人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、【目的】研究臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)條件，探討臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞治療種子細(xì)胞的可行性。 【方法】無菌條件下取正常足月產(chǎn)臍帶血36份，CAPD-1復(fù)合抗凝劑抗凝。其中18份臍血采用直接分離法，即將臍血稀釋后，直接用Ficoll分離單個核細(xì)胞，分別采用含5％、10％、20％血清濃度的L-DMEM常規(guī)間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)；其余18份臍血采用間接分離法，即將臍血用5g/L的甲基纖維素先沉降出紅細(xì)胞，然后將富集到的白細(xì)胞用

2、Ficoll進(jìn)行密度梯度離心，獲得單個核細(xì)胞，同樣分別采用含5％、10％、20％血清濃度的L-DMEM進(jìn)行培養(yǎng)；另外，無菌條件下取11份骨髓，按常規(guī)間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)法，分離培養(yǎng)骨髓作為陽性對照。對不同方法富集到的臍血單個核細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行對比，對臍血原代和傳代細(xì)胞的貼壁時間、貼壁細(xì)胞類型、生長速度進(jìn)行觀察記錄，對各臍血組成功培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞的例數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對分離出的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對比，采用流式細(xì)胞儀考

3、察臍血及骨髓中單個核細(xì)胞的細(xì)胞亞群以及間充質(zhì)干細(xì)胞存在情況。 【結(jié)果】 1、兩種方法分離臍血單個核細(xì)胞的比較直接和間接分離法獲得的臍血有核細(xì)胞數(shù)量分別為(3.2±2.O)×10<'6>、(1.O±O.5)×10<'8>，存在顯著性差異(P<0.05)；兩種方法分離的有核細(xì)胞死亡率無顯著性差異(P>0.05)；兩種方法分離的細(xì)胞培養(yǎng)7天后在30<'2>cm培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞克隆數(shù)分別為22±15，43±8，存在顯著性差異(

4、P<0.05)。 2、臍血組間充質(zhì)干細(xì)胞生長特性并與骨髓組進(jìn)行比較 臍血單個核細(xì)胞培養(yǎng)72小時后貼壁細(xì)胞均出現(xiàn)兩種形態(tài)，即梭形纖維狀的細(xì)胞和圓形細(xì)胞。經(jīng)過傳代擴(kuò)增，有7／36份臍血出現(xiàn)均一旋渦狀排列的間充質(zhì)樣的細(xì)胞，形態(tài)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相同，其余29／36份臍血傳代后仍保持單核樣的圓形細(xì)胞及少量梭形細(xì)胞混雜，胰酶難以消化下來，不能分離純化出間充質(zhì)樣的細(xì)胞，最終老化死亡。骨髓組單個核細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，貼壁細(xì)胞多數(shù)為纖

5、維樣的間充質(zhì)細(xì)胞，圓形貼壁細(xì)胞少，傳代后11／11份骨髓均分離出了間充質(zhì)樣梭形細(xì)胞。兩種不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)相同，但臍血間充質(zhì)干細(xì)胞生長速度明顯慢于骨髓。 3、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記特征 流式細(xì)胞儀檢測顯示，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞仍表達(dá)典型的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記，即CD29(+)、CD44(+)、CDl05(+)，而CD34(-)。但與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比較存在表達(dá)數(shù)量上的差異，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞CDl05表達(dá)數(shù)量明顯少于

6、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 4、臍血分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞成功率 臍血組分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞總的成功率為20％，骨髓組共分離培養(yǎng)11次，均獲得成功(100％)。不同的臍血分離培養(yǎng)法其成功率有顯著差異，其中直接法為11％，間接法33.3％。不同的血清濃度對培養(yǎng)成功率有一定的影響，其中以10％的血清濃度成功率最優(yōu)，直接法為16.7％，間接法為33.3％。 5、臍血和骨髓單個核細(xì)胞CD29／CD34雙色標(biāo)記流式檢測CD29(PE

7、)、CD34(FITC)雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：臍血中可能的間充質(zhì)干細(xì)胞群CD29(+)／CD34(-)細(xì)胞僅占全部單個核細(xì)胞的1.8％；而骨髓中CD29(+)／CD34(-)細(xì)胞群占單個核細(xì)胞的12.4％。 【結(jié)論】 1、分離獲得單個核細(xì)胞數(shù)量對臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的成功培養(yǎng)有很大的影響。采用甲基纖維素分離的間接法能顯著提高間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的成功率。 2、單個核細(xì)胞的接種量和血清濃度對間充質(zhì)干細(xì)胞成功培養(yǎng)有