體外研究人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠枯否細(xì)胞M2極化.pdf

1、目的：眾所周知，目前晚期肝硬化患者除肝移植外無較好的治療方法，但肝移植供體緊缺，配型復(fù)雜，等待周期長，移植費(fèi)用高，極大的限制了肝移植的臨床應(yīng)用。隨著干細(xì)胞替代治療研究的興起，目前干細(xì)胞移植有望成為終末期肝病的有效治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)具有強(qiáng)大的分化能力能為許多終末期疾病帶來希望，是一種多能干細(xì)胞。具有提取方法簡單，低成本，低免疫性等特點(diǎn)。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明MSCs通

2、過免疫調(diào)節(jié)或者分泌細(xì)胞因子的機(jī)制來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，從而發(fā)揮其主要的治療作用。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)大鼠枯否細(xì)胞(kupffer cells,KCs)發(fā)生極化改變，之后用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，huMSCs)與LPS誘導(dǎo)的KCs在transwell內(nèi)共培養(yǎng)，觀察huMSCs對KCs極化偏移

3、的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步來研究MSCs對炎癥免疫調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制。
　　方法：采用膠原酶在體灌注和離體消化、密度梯度離心和選擇性貼壁法，并結(jié)合機(jī)械分離和振蕩孵育，最大程度的消化SD大鼠肝組織從而高效得到更多的原代KCs。經(jīng)過形態(tài)觀察，吞噬功能檢測，細(xì)胞表面標(biāo)志檢測等方法驗(yàn)證細(xì)胞。成功取得KCs后，進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)進(jìn)行huMSCs細(xì)胞培養(yǎng)，觀察，驗(yàn)證。之后將KCs與MSCs在Transwell內(nèi)共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為KCs組(正常組)，KCs細(xì)胞

4、+LPS組(對照組)，MSCs+KC+LPS組(實(shí)驗(yàn)組)。實(shí)驗(yàn)組用經(jīng)典的LPS刺激原代大鼠KCs發(fā)生極化后再與huMSCs共培養(yǎng)18h，正常組加入等量DMEM培養(yǎng)基，對照組在LPS刺激后，加入DMEM培養(yǎng)基作為對照。觀察同一時(shí)間點(diǎn)各組的IL-4，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，IL-10，IL-6等上清因子變化，以上上清因子用ELISA法進(jìn)行檢測；用Westing-blot方法檢測誘導(dǎo)型一氧化

5、氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)，精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)，信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)STAT-3，STAT-6，核因子kappaB(nuclear factor-kB，NF-κB)。同時(shí)用qRT-PCR對以上結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。檢測結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

6、差(X±S)表示，F(xiàn)檢驗(yàn)判斷兩樣本間的方差齊性，多組間差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析，t檢驗(yàn)分析兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：對照組促炎因子TNF-α分泌增加，實(shí)驗(yàn)組抑炎因子IL-10，IL-4分泌增加，而IL-6的分泌實(shí)驗(yàn)組升高更明顯；而Western-blot檢測表明對照組中iNOS升高，NF-κBp65入核增高，而實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)Arg-1，同時(shí)pSTAT-3，pSTAT-6表達(dá)增加，NF-κBp65入核減少，但是NF-κBpp65

7、核內(nèi)增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測結(jié)果提示huMSCs與枯否細(xì)胞極化后共培養(yǎng)后與對照組及空白組存在明顯差異。
　　結(jié)論：分析以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明huMSCs能誘導(dǎo)KCs向M2表型偏移，主要表現(xiàn)為抗炎因子分泌增加，Arg-1合成增加，考慮可能與huMSCs分泌細(xì)胞因子有關(guān)，起到一種免疫調(diào)節(jié)作用，huMSCs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制可能與通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。該結(jié)論首次用不同種屬細(xì)胞共培養(yǎng)研究巨噬細(xì)胞極化問題，且采用原代大鼠枯否細(xì)胞