人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、目的:建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增的方法，觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生物學(xué)特性，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞表型，分析鑒定MSCs的純度。
　　方法:
　　本論文采用的主要研究方法如下:
　　(1)無菌條件下抽取骨髓液5mL，用等體積PBS稀釋混勻，室溫下1500rpm離心10分鐘，棄去脂肪層，將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液(1.077g/mL)上面，室溫2500rpm離

2、心30分鐘，吸取界面白膜狀層的單個(gè)核細(xì)胞。用PBS混懸后，室溫1500rpm離心10分鐘，棄上清并重復(fù)洗滌2次。用含10％ FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3天后首次換液，棄去懸浮細(xì)胞后，每2～3天換液一次。每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長變化，待細(xì)胞生長達(dá)80％～90％融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶-0.02％ EDTA(1∶1，

3、V/V)進(jìn)行消化，再按1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，共傳代三次。
　　(2) MSCs的生長曲線測(cè)定:取P3細(xì)胞，按5×104/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每天取3孔，計(jì)算平均值，連續(xù)培養(yǎng)8天，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，繪制生長曲線。
　　(3)貼壁率測(cè)定:取P3細(xì)胞，按5×104/mL濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每2小時(shí)取2瓶，消化計(jì)數(shù)，計(jì)算貼壁率，繪制貼壁率曲線。
　　(4) MSCs的表型鑒定:取P3細(xì)胞，將細(xì)胞

4、消化吹打制成單細(xì)胞懸液，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS重復(fù)洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，各取細(xì)胞懸液100μL，分別滴加熒光標(biāo)記抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、HLA-DR-PE抗體10μL，4℃避光孵育30分鐘，PBS洗滌后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，確定MSCs的表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1) MSCs屬于骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，采

5、用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合可以有效分離、純化人骨髓MSCs。細(xì)胞形態(tài)觀察:細(xì)胞初接種入培養(yǎng)瓶時(shí)為圓形的單個(gè)核細(xì)胞，大小不一，與周圍的血細(xì)胞相互混雜。培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁，48～72小時(shí)細(xì)胞貼壁逐漸增多，72小時(shí)首次換液后，可見少量分散的短梭形及不規(guī)則多角形的初始貼壁細(xì)胞。第4～8天細(xì)胞生長快，呈集落樣生長，可見有粗大的突起伸出，細(xì)胞形態(tài)呈梭形。第10-12天后細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大，呈大的長梭形，培養(yǎng)至第14～16天時(shí)貼

6、壁細(xì)胞可達(dá)80％～90％融合，大量貼壁細(xì)胞呈長梭狀成纖維細(xì)胞樣形態(tài)并列或呈漩渦狀排列。傳代細(xì)胞剛接種時(shí)為圓形，較大，24小時(shí)內(nèi)能完全貼壁，伸展呈梭形，增殖迅速，5-7天細(xì)胞融合可達(dá)90％。細(xì)胞形態(tài)均勻，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，大部分呈長梭狀，排列規(guī)則。
　　(2) MSCs的生長曲線分析:細(xì)胞生長曲線呈S形，原代細(xì)胞生長比傳代細(xì)胞慢。原代細(xì)胞接種后第0～3天為生長潛伏期;第4～12天為對(duì)數(shù)生長期;此后逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)期。傳代細(xì)胞培

7、養(yǎng)時(shí)第1～2天細(xì)胞生長處于潛伏期，第3天開始細(xì)胞生長較快，至第6～7天達(dá)頂點(diǎn)，后進(jìn)入平臺(tái)期。
　　(3)測(cè)定貼壁率:傳代后的細(xì)胞貼壁較快，4小時(shí)貼壁細(xì)胞超過50％，而12小時(shí)左右超過90％的細(xì)胞已經(jīng)貼壁。
　　(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3細(xì)胞顯示:CD29、CD44、CD105的陽性表達(dá)率分別為99.82％、99.82％、97.38％，對(duì)CD34、HLA-DR的陽性表達(dá)率分別為4.94％、1.87％。
　　結(jié)論: