正常及再障模型小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓中造血干細(xì)胞之外的另一類干細(xì)胞。它具有極高的橫向分化和復(fù)制能力，在不同誘導(dǎo)條件下具有多向分化潛能。目前常用于培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度分離法。前者簡(jiǎn)單易行，將骨髓全部接種，利用干細(xì)胞貼壁時(shí)間短，通過換液達(dá)到分離、純化的目的；后者是將淋巴細(xì)胞分離液分離出的單個(gè)核細(xì)胞接種。目前尚無一種標(biāo)志物能作為MSCs的身份特征

2、，國(guó)際上通常采用多種CD分子的組合綜合界定。MSCs是正常造血功能賴以存在和發(fā)揮功能的必要支持，因而在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)以小鼠骨髓為MSC來源，旨在摸索有效、可行的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，對(duì)所培養(yǎng)的BMMSC進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)這種培養(yǎng)法的產(chǎn)率。 臨床上惡性血液病患者經(jīng)反復(fù)放、化療，常出現(xiàn)骨髓造血恢復(fù)延遲，有較長(zhǎng)時(shí)間的低細(xì)胞期。研究表明：骨髓恢復(fù)延遲可能與骨髓基質(zhì)損傷有關(guān)。BMMSC是骨髓基質(zhì)的組成之

3、一，故我們利用小鼠研究BMMSC損傷時(shí)的分離、培養(yǎng)，并觀察此時(shí)小鼠BMMSC的狀況，為臨床治療方面提供新的思路。 方法： 1、動(dòng)物：選用清潔級(jí)4～6周齡BALB/c(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)為骨髓細(xì)胞來源。清潔級(jí)4～6周齡DBA/2(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)為免疫細(xì)胞來源，飼養(yǎng)于無菌層流柜中。 2、MSC的分離和培養(yǎng) 全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法：將BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，超凈臺(tái)內(nèi)無菌分離

4、小鼠股骨及脛骨，以CCM(完全培養(yǎng)基，為F12-DMEM培養(yǎng)液，含青霉素100μg/ml、鏈霉素100μg/ml、hEPES液0.03mol/L以及10％FBS)沖洗骨髓腔，輕柔吹打沖洗液，制成單細(xì)胞懸液，直接接種于25cm<'2>一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶中，為P0(Passage 0)代。每瓶培養(yǎng)基體積補(bǔ)足至5ml。細(xì)胞終濃度約為1×10<'8>/L，37℃，5％CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)。所用小鼠只數(shù)與接種瓶數(shù)比例為1∶1。 密度

5、梯度離心法：以同上方法獲得骨髓細(xì)胞，離心，用CCM重懸沉淀，緩慢加于Ficoll分離液(p=1.077g/ml)上，常溫離心(1500rpm，15min)，吸取界面層細(xì)胞，無菌PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌2次，以CCM調(diào)整細(xì)胞濃度至7～8×10<'6>L培養(yǎng)為PO’代。培養(yǎng)及傳代條件同前。 全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法72小時(shí)首次全量換液；密度梯度離心法72小時(shí)首次半量換液。此后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)基顏色等客觀條件，約每2～3天適時(shí)換液

6、。細(xì)胞逐漸貼壁、融合。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80～90％融合時(shí)，0.25％胰蛋白酶消化、傳代。第一代為P1，第二代為P2，以此類推。 每種方法組種植5瓶細(xì)胞，分別選取兩組生長(zhǎng)好的不同代細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，繪制生長(zhǎng)曲線。 3、MSC的鑒定 3．1倒置顯微鏡下直接觀察活體細(xì)胞形態(tài)，適時(shí)留取照片； 3．2選取不同代數(shù)的MSC制作細(xì)胞爬片，瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及不同傳代數(shù)對(duì)其影響； 3．3選取抗

7、鼠CD34、CD414、CD45三種單抗，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行MSCs細(xì)胞免疫表型測(cè)定； 3．4誘導(dǎo)分化 3．4．1成骨分化誘導(dǎo)體系：地塞米松(10<'-7>mol/L)、β-甘油磷酸鈉(10mmol/L)、維生素C(50mg/L)，以CCM為溶劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，可見鈣化結(jié)節(jié)時(shí)，ALP染色，證實(shí)分化效果。 3．4．2成脂分化誘導(dǎo)體系：地塞米松1μmol/L、胰島素10mg/L，以CC

8、M為溶劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)脂肪空泡時(shí)，油紅O染色，證實(shí)分化效果。 4、免疫介導(dǎo)再障模型小鼠的構(gòu)建，分三組進(jìn)行： 單純照射組：BALB/c小鼠，lO只，雌雄各半，<'60>Co γ射線8Gy照射。 脾細(xì)胞組：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<'60>Coγ射線8Gy照射后4h內(nèi)由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠脾臟的單細(xì)胞懸液0.2ml(細(xì)胞數(shù)為1×10<'6>)。 假照

9、射組(對(duì)照組)：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<'60>Coγ射線8Gy照射時(shí)以鉛磚屏蔽，照射后4h內(nèi)由尾靜脈輸入0.2ml生理鹽水。 三組均于第7、15、30天行血常規(guī)檢查。 5、選取血象最低時(shí)及血象恢復(fù)后的存活小鼠，按第一部分中的全骨髓培養(yǎng)法，分離、培養(yǎng)小鼠BMMSCs，與來源于正常小鼠的BMMSC作對(duì)照。每日在倒置顯微鏡下觀察活體細(xì)胞形態(tài)，適時(shí)留取照片。MTT法繪制生長(zhǎng)曲線。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：血常規(guī)數(shù)

10、據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)各組間差異，方差不齊者改用非參數(shù)檢驗(yàn)，取α=0.05。結(jié)果1在我實(shí)驗(yàn)室條件下，全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法及梯度密度離心法均能成功地培養(yǎng)出BMMSCs。原代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示前者細(xì)胞貼壁早，生長(zhǎng)快，更早達(dá)到傳代規(guī)模。與后者比較有顯著差異。達(dá)到傳代規(guī)模時(shí)的培養(yǎng)天數(shù)均數(shù)為D<,P0>∶D<,P0>=9.6±1.14：14.2±1.48(p<0.05)。 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力(貼壁率)：P0/P0’細(xì)胞第1～2天變化

11、不大，可能為細(xì)胞生長(zhǎng)的潛伏適應(yīng)期；第3天后貼壁顯著增加，提示細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第6天起增長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期。從P2開始，傳代間隔逐漸縮短(P0要約14天，P1約10天，P2約1周，P3約3～4天)。從P4起，約消化傳代第2天，細(xì)胞就可以貼壁達(dá)到60～70％的融合。 2．MSC形態(tài)學(xué)觀察：急性分離的小鼠骨髓細(xì)胞接種4小時(shí)后，部分細(xì)胞貼壁，呈圓形。24小時(shí)后呈紡錘形、梭形、多角形等，形態(tài)多樣，部分細(xì)胞形成集落，增殖迅速，集落之間相

12、互靠近。達(dá)80～90％融合時(shí)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有梭形、星形、多角形等。胞體肥大，胞質(zhì)豐富。P3以后，融合后的細(xì)胞呈旋渦狀，細(xì)胞形態(tài)較前均一。 瑞-吉染色MSC形態(tài)觀察：P0～P2時(shí)，MSCs高倍鏡下細(xì)胞呈梭形、星形、多角形等，胞體肥大，胞質(zhì)豐富，有細(xì)長(zhǎng)、分叉的突足，細(xì)胞核大而疏松，核仁明顯，可見到處于分裂相的核仁。P3以后細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向均一，呈成纖維樣集落狀生長(zhǎng)并相互融合。P7以后逐漸出現(xiàn)“旋渦”樣集落，細(xì)胞密度極大。

13、流式細(xì)胞學(xué)分析各期MSCs表面抗原：P0表面抗原表達(dá)譜為9.03％CD34，1.86％CD44，100％CD45，P3表面抗原表達(dá)譜為0.04％CD34，97.37％CD44，4.29％CD45。多向分化：成脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞誘導(dǎo)體系可以誘導(dǎo)P3及以后的培養(yǎng)細(xì)胞分別分化為具有脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞特點(diǎn)的細(xì)胞。 3脾細(xì)胞組小鼠于照射后第8天起陸續(xù)出現(xiàn)皮毛散亂、體重下降、蒼白萎靡。外周血象于照射后開始下降，持續(xù)減低15天以上。第7天白細(xì)

14、胞水平達(dá)到最低點(diǎn)，顯著低于正常。單純照射組小鼠血象在第15天已開始恢復(fù)。假照射組小鼠無上述變化。 脾細(xì)胞組第7、15天的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，急性分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于正常對(duì)照組，細(xì)胞形態(tài)基本與對(duì)照組無明顯區(qū)別。細(xì)胞接種后72小時(shí)后始有少量細(xì)胞貼壁，大部分細(xì)胞懸浮、死亡。貼壁細(xì)胞形態(tài)為圓形或多角形。生長(zhǎng)曲線顯示其生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組。 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，脾細(xì)胞組MSCs集落形成慢，數(shù)量少，細(xì)胞

15、增殖緩慢。培養(yǎng)2周后，細(xì)胞融合不足50％，并且逐漸有細(xì)胞漂浮、死亡。培養(yǎng)3周，所剩細(xì)胞已不足20％，不能滿足傳代要求。脾細(xì)胞組第30天的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，與對(duì)照組相比，無明顯差異。 結(jié)論 1、全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法較梯度密度離心法可以更有效地獲取小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞： 2、P3～P12 MSCs具有表型均一的特點(diǎn)和多向分化能力； 3、兩種方法所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面免疫表型測(cè)定符合MSC特點(diǎn)，均