山羊骨髓間充質干細胞體外分離與培養(yǎng).pdf

1、該研究基于細胞工程與轉基因技術相結合,把誘骨因子hBMP-2基因整合到靶細胞BMSC中,再將BMSC植入骨損傷處,讓hBMP-2基因在體內穩(wěn)定地表達,從而達到hBMP-2基因基因治療的目.所作的工作如下:1.采用密度梯度離心(Percoll分離液)法將BMSC從山羊骨髓血液中分離出來,置于低糖DMEM中進行傳代培養(yǎng).利用換液的方法對其純化,接種兩小時后開始貼壁,貼壁生長的細胞呈典型的成纖維細胞樣外觀.原代與傳代培養(yǎng)細胞的生長曲線都為S型

2、,但是傳代培養(yǎng)的細胞生長速度比原代快.傳代培養(yǎng)的結果顯示,在經歷了9代培養(yǎng)以后,山羊BMSC才出現(xiàn)衰老征象.與原代培養(yǎng)細胞的生長曲線相比,傳代培養(yǎng)的細胞生長潛伏期短,每代只要9天就可鋪滿培養(yǎng)皿底壁.2.參考上皮細胞的冷凍方法,用含不同濃度的血清和DMSO的冷凍液進行冷凍,以解凍后的細胞貼壁率為標準,篩選理想的冷凍液.發(fā)現(xiàn)凍存液DMEM+10%FBS+10%DMSO與DMEM+15%FBS+10%DMSO對山羊BMSC的冷凍有著相同的效果

3、,因此選擇DMEM+10%FBS+10%DMSO為山羊BMSC的冷凍液.3.取P1、P5和P9代細胞制備細胞爬片,用β-巰基乙醇/當歸注射液分別對其進行定向誘導,每隔30min在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,用免疫組織化學鑒定.結果表明β-巰基乙醇和當歸注射液對山羊BMSC有同樣的誘導效果,兩種方法誘導后的細胞70%以上表達神經絲蛋白(NF)和神經元特異性烯醇化酶(NSE).說明山羊BMSC同樣可以被誘導成為神經樣細胞,同時也說明了采用

4、Percoll分離液進行梯度密度離心后分離的細胞為BMSC.4.采用TRIZOL法從人胎盤組織中提取總RNA,通過RT-PCR方法獲得編碼hBMP-2的基因,重組到pMD-18T載體上后在大腸桿菌中克隆,經檢測,所獲得的基因序列與基因文庫中hBMP-2基因同源性為99.9%,即成功的克隆出了hBMP-2基因,為進一步研究hBMP-2基因在BMSC中的高效表達奠定了基礎.5.把目的基因從重組質粒上切下來,插入到熒光表達載體(pEGFP-C