SDF-1修飾人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)鑒定的研究.pdf

1、目的：造血微環(huán)境損傷是引起某些疾病及造血干細胞移植時造血重建不良的重要原因。骨髓基質細胞是造血微環(huán)境的主要成分，對造血干/祖細胞的粘附作用是促使造血干/祖細胞回髓定植和進一步增殖分化的基礎。而骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓中除造血干細胞(hemopoieticstemcells，HSCs)以外的另一種干細胞，不僅直接參與生成造血微環(huán)境支持造血，在適宜的條件下還可發(fā)

2、育、分化為具有支持造血功能的多種骨髓基質細胞。因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能等，是細胞替代和基因治療理想的細胞來源。尤其在造血干細胞移植過程中，可以糾正或改善造血微環(huán)境的損傷，從而促進移植后造血和免疫功能的重建。 基質細胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor-1，SDF-1)主要由骨髓基質細胞合成和分泌，同時，BMSCs也可合成、分泌SDF-1，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分。人SDF-1基因定

3、位于10號染色體，根據(jù)其編碼氨基酸序列歸屬于趨化因子CXC亞家族，與其表達于造血干細胞表面的唯一受體CXCR4結合參與造血的調控。在造血干細胞動員、歸巢、定植和增殖中發(fā)揮重要作用，并可單獨或協(xié)同G-CSF、TPO等細胞因子通過細胞信號轉導系統(tǒng)維持造血干細胞的正常功能。 本實驗在成功分離、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)和構建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達載體的基礎上，將重組質粒傳染入hBMSCs，并檢測其

4、瞬時轉染效率，為進一步的體內外實驗研究SDF-1修飾hBMSCs對造血的支持作用奠定基礎。 方法： 一、共采集25例骨髓標本，均取自第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院血液科15歲至40歲正常、缺鐵性貧血及特發(fā)性血小板減少性紫癜患者；攜帶SDF-1cDNA的質粒pCMV-SPORT6載體購自ATCC公司，Number：47612；pIRES2-EGFP真核表達載體為本實驗室保存。 二、通過密度為1.073kg/L的Perco

5、ll液，利用密度梯度離心法分離出人骨髓單個核細胞(mononuclearcells，MNCs)，通過貼壁篩選法建立hBMSCs的體外培養(yǎng)體系，并通過一系列檢測方法對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。 三、XhoI/EcoRI雙酶切攜帶有SDF-1cDNA的質粒pCMV-SPORT6獲取SDF-1cDNA片段，并將其定向克隆到pIRES2-EGFP真核表達載體中，構建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達載體。 四、脂質體介導未去

6、內毒素質粒SDF-1-pIRES2-EGFP轉染hBMSCs，觀測內毒素對細胞的影響；去內毒素質粒SDF-1—pIRES2-EGFP轉染hBMSCs，通過熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白(EGFP)的表達和半定量RT-PCR法檢測其瞬時轉染效率。 五、通過預實驗確定獲取穩(wěn)定轉染細胞所需的G418篩選濃度。 結果： 實驗主要結果如下： 一、人骨髓間充質干細胞的生物學特征及鑒定：細胞主要呈“成纖維樣”，但體積較大、

7、形狀不規(guī)則、胞漿突起多，細胞核大而疏松，核仁明顯。流式細胞儀檢測：CD34陽性率2.09％、CD29的陽性率94.46％；CD54及CD105表達陽性(因其熒光分布區(qū)域和對照管細胞的熒光分布區(qū)域相重疊，不適宜用陽性率表達，而是用熒光強度代表其抗原表達強弱：CD54為26.36；CD105為82.31)。細胞周期及透射電鏡檢測提示細胞處于相對原始狀態(tài)。免疫細胞化學染色顯示：CD14、CD45、膠原蛋白Ⅱ呈陰性；CD106、CD166、纖維

8、連接蛋白、Vimentin及膠原纖維酸性蛋白(GFAP)呈陽性。細胞化學染色：糖原染色呈強陽性；堿性磷酸酶染色呈陰性。通過誘導分化培養(yǎng)可誘導出成骨細胞。以上一系列檢測提示hBMSCs分離培養(yǎng)成功。同時，顯示hBMSCs可傳代培養(yǎng)，但是細胞逐漸出現(xiàn)老化現(xiàn)象，且不能凍存。 二、SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達載體的構建：pCMV-SPORT6攜帶的SDF-1cDNA測序后定向克隆至pIRES2-EGFP真核表達載體中，構建

9、SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達載體；測序證實所攜帶的SDF-1cDNA與GeneBank公布序列一致，定向構建的重組載體連接方向和開放閱讀框正確，證明載體構建成功。 三、未去內毒素重組質粒轉染人骨髓間充質干細胞：因內毒素的細胞毒性造成靶細胞大量死亡，轉染失敗。 四、去內毒素重組質粒轉染人骨髓間充質干細胞后48小時置熒光纖維鏡下觀察：可見EGFP表達，提示載體基因轉染入靶細胞內。 五、轉染前/后SDF-

10、1cDNA在人骨髓間充質干細胞中表達情況的檢測：采用RT-PCR從mRNA水平進行檢測。以β-actin(587bp)作為內參，經quality-one軟件分析，轉染組和對照組細胞SDF-1/β-actin的光密度比值分別為0.86和0.71。結果表明瞬時轉染SDF-1-pIRES2-EGFP質粒的hBMSCs的SDF-1mRNA表達增高約20％左右。 六、經預實驗確定G418篩選濃度：250μg/ml為第8天細胞全部死亡的最低

11、濃度，定為進一步實驗獲取穩(wěn)定轉染細胞的篩選濃度。 結論： 一、建立了穩(wěn)定的人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)體系，按照此培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)可以成功獲得人骨髓間充質干細胞； 二、成功構建了攜帶有neo基因及表達EGFP基因的SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達載體，可以用于轉染人骨髓間充質干細胞； 三、用所構建的SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達載體轉染人骨髓間充質干細胞，并且通過熒光顯微鏡觀測EGFP