人骨髓間充質(zhì)干細胞對人精原干細胞體外增殖的影響.pdf

1、目的：探討人骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)體外分離及純化的方法；人精原干細胞(Spermatogonialstem cells，SSCs)在人骨髓間充質(zhì)干細胞飼養(yǎng)層上的生物學(xué)特征及增殖的可能機制。 方法： ①人骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定：流產(chǎn)4h胎兒取雙側(cè)股骨，去除貼附在骨表面的肌肉組織，剪斷兩端骨垢，用DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔細胞入離心管，吹打后離心

2、8min(速度1000r/s)，去上清，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為6×105/mL接種，將細胞置于37℃恒溫、5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)4h后，換液去除未貼壁細胞，以后每3d換液。當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時傳代，傳代前24h細胞換液；吸出廢液，PBS沖洗，加含有EDTA的胰酶消化2min，Hank's終止消化，吹打，離心，按1：2的比例傳代，將細胞置37℃孵箱培養(yǎng)，4h換液，進一步純化BMSC，以后每3

3、d換液。倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)及生物學(xué)特征，應(yīng)用MTT法間接測定各代骨髓間充質(zhì)干細胞活性。檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物CD44。 ②人支持細胞培養(yǎng)及鑒定：無菌條件下剪開睪丸囊取出睪丸置培養(yǎng)皿中，去白膜后移至試管內(nèi)盡可能剪碎，加入十倍體積的1mg/mL膠原酶Ⅳ，在37℃、5％CO2條件下作用20min，靜止后去上清，加0.25％胰酶消化4min，加含血清DMEM終止消化，吹打，靜止后取上清，離心8min(速度100

4、0r/s)，去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度至3×105個/mL接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，將細胞置于37℃恒溫、5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)4h，換液去除未貼壁細胞。當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時傳代，傳代前24h細胞換液。吸除廢液，PBS沖洗，加含有EDTA的胰酶消化2min，加Hank's終止消化，吹打使細胞重懸，離心，按1：2的比例傳代，將細胞置37℃孵箱培養(yǎng)，以后每3d換液。鑒定：支持細胞的油紅0染色，用以鑒定支持

5、細胞。 ③飼養(yǎng)層的制備：當(dāng)培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時，用含10 ug/mL絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)基處理同代的兩組骨髓間充質(zhì)細胞各1.5h，PBS液清洗后隨機取一組作為飼養(yǎng)層備用，另一組作為對照組(CG)。當(dāng)培養(yǎng)的人支持細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70％-80％時，用絲裂霉素C處理，方法同上，作為飼養(yǎng)層備用。 ④精原干細胞的純化及鑒定：取材方法同培養(yǎng)支持細胞。將睪丸細胞懸液置于37℃恒溫、5％CO2的孵箱內(nèi)

6、培養(yǎng)，4h后吸取培養(yǎng)液，8min(速度1000r/s)離心后，去上清加含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打，取少許細胞滴片檢測Thy-1，剩余細胞調(diào)整濃度至3×105個/mL，接種到準(zhǔn)備好的骨髓間充質(zhì)干細胞和支持細胞飼養(yǎng)層上，分別作為實驗組1(E-1)和實驗組2(E-2)。 ⑤ELISA法檢測對照組、實驗組1培養(yǎng)液中的白血病抑制因子(LIF)。隔日換液，并收集兩組上清液，凍存于-20℃低溫冰箱中儲存，直至SSCs進入指數(shù)增長期

7、后。將兩組上清液解凍作酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗，檢測LIF的含量，兩組進行對比，并作統(tǒng)計分析。 ⑥對比以骨髓間充質(zhì)干細胞為飼養(yǎng)層和支持細胞為飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)的SSCs增殖情況。在培養(yǎng)瓶自建坐標(biāo)，在四個象限分別選相應(yīng)的四個固定視野，每日拍照并計數(shù)SSCs，直至兩組SSCs都達到指數(shù)增長期后，對比兩組SSCs增殖情況，最后利用SSCs表面特異性標(biāo)志物Thy-1做免疫組織化學(xué)鑒定。 結(jié)果： ①培養(yǎng)4h，見骨髓間充質(zhì)

8、干細胞已開始貼壁，培養(yǎng)7d時，見細胞鋪滿瓶壁面積的70％-80％，細胞排列緊密，此時骨髓間充質(zhì)干細胞鋪成單層；H-E染色見細胞多為長梭型，有突起及分支，胞體大，核一個，較大，呈圓形，著色淺；骨髓間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物CD44免疫組織化學(xué)陽性； ②對照組的骨髓間充質(zhì)干細胞上清液中LIF的含量較對照組高。 ③精原干細胞在支持細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞為飼養(yǎng)層上均能夠保持非分化增殖，且在骨髓間充質(zhì)干細胞上增殖的速度較在支持細胞上增