芍藥苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、研究背景：芍藥苷是中藥芍藥的主要活性單體成份，具有養(yǎng)血柔肝之功效并能調(diào)節(jié)人體的免疫功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是人體造血微環(huán)境的重要組成部分，通過與骨髓造血干祖細(xì)胞直接接觸，并分泌多種造血相關(guān)因子及細(xì)胞外基質(zhì)，維持骨髓造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能的完整性。除此之外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有多種作用于B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的效應(yīng)，其構(gòu)成了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異的免疫調(diào)節(jié)功能，故骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人體的造血機(jī)制及免疫重

2、建功能起著十分重要的調(diào)控作用。芍藥苷作為中藥芍藥的主要活性成分，其補(bǔ)血及免疫調(diào)節(jié)作用是否是通過間充質(zhì)干細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，是否與間充質(zhì)干細(xì)胞有關(guān)，以及芍藥苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)有何影響，目前報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，觀察芍藥苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子的影響，以期闡明芍藥苷補(bǔ)血及調(diào)節(jié)免疫作用的藥理學(xué)機(jī)制，從而為芍藥苷的臨床使用和研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究目的：通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，分離

3、擴(kuò)增培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察并了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征及生長增殖規(guī)律等生物學(xué)特性。以芍藥苷與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的方式，探討芍藥苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及IL-6表達(dá)的影響，以此分析芍藥苷的補(bǔ)血及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究方法：采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型特征，成骨成脂法觀察細(xì)胞的分化潛能。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法

4、檢測(cè)不同濃度芍藥苷對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定芍藥苷干預(yù)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，培養(yǎng)上清液中IL-6的分泌水平，RT-PCR法檢測(cè)芍藥苷干預(yù)后IL-6基因的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成功分離出人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。原代培養(yǎng)12 d的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，呈多角形或圓形緊密排列，具有較強(qiáng)的增殖能力；傳代后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞快速生長，6d左右即達(dá)90％融合，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)均一，為長梭形，排列規(guī)則，漩渦

5、狀生長。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍保存和復(fù)蘇前后，細(xì)胞生長特性和生理功能無明顯變化。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)為CD29、CD44及CD105高表達(dá)，CD34、CD45及HLA-DR低表達(dá)。成骨和成脂定向培養(yǎng)顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具備向成骨、成脂細(xì)胞分化的能力。與對(duì)照組相比，2μmol/L和10μmol/L濃度的芍藥苷可明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。10μmol/L芍藥苷干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，G0/G1

6、期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例顯著升高。10μmol/L芍藥苷干預(yù)組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞IL-6的分泌和mRNA表達(dá)均明顯高于對(duì)照組?？梢?，一定濃度的芍藥苷可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，并提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞IL-6分泌水平和基因表達(dá)。
　　結(jié)論：芍藥苷或許是通過促進(jìn)骨髓或外周血中間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，促使其高分泌IL-6等細(xì)胞因子，而IL-6與其它細(xì)胞因子協(xié)同作用于骨髓造血干祖細(xì)胞及相關(guān)組織的免疫細(xì)胞，從而起到調(diào)節(jié)機(jī)體造血及免疫功能