人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 研究目的：臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞（Wharton’s jelly-derived mesenchymAlstemcells, WJMSCs）是來源于臍帶血管周圍華通膠組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的基本特征，即該細(xì)胞具有自我更新及向不同組織或細(xì)胞分化的能力。本研究從人臍帶中分離提取華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察其細(xì)胞形態(tài)，檢測其增殖能力、細(xì)胞免疫表型及端粒酶活性，鑒定分離提取的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，為下一步通過細(xì)胞共培養(yǎng)

2、的方法定向誘導(dǎo)分化為髓核細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：取足月產(chǎn)健康新生兒臍帶，分離華通膠組織，剪碎后用膠原酶和胰蛋白酶消化，提取細(xì)胞后加DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)到80-90％時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，測定不同代次的細(xì)胞增殖能力。取第3代細(xì)胞行端粒酶活性分析及流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞免疫表型(CD34/CD45/CD105/CD73/CD90/HLADR及HLA-ABC)。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)第3

3、-5天可見部分細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為梭形和多角形，1周后形成集落，2周時細(xì)胞融合達(dá)到90％。傳代后細(xì)胞為梭形，形態(tài)一致，細(xì)胞呈漩渦狀生長，細(xì)胞增殖能力強，5-6天即可進(jìn)行傳代，傳至16代增殖能力未見下降。端粒酶活性測定為陽性，流式細(xì)胞分析細(xì)胞免疫表型結(jié)果表明，CD90/CD105/CD73/HLA-ABC陽性，CD34/CD45/HLA-DR陰性。
　　 結(jié)論：人臍帶含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過酶消化法可從臍帶華通膠中提取間充質(zhì)干

4、細(xì)胞，該細(xì)胞呈梭形，漩渦狀生長，增殖能力強。流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞免疫表型顯示細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型，不表達(dá)造血干細(xì)胞免疫表型，其端粒酶活性陽性。華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞由于其更強的增殖活性、更好擴增能力及更易于獲取而有望成為組織工程和細(xì)胞治療技術(shù)的理想種子細(xì)胞。
　　 第二部分
　　 研究背景和目的：椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease, DDD)是常見病多發(fā)病，其引起的下腰痛嚴(yán)重影響人們

5、的工作及生活。目前的治療方法主要是保守治療和外科治療，雖能暫時緩解臨床癥狀，但遠(yuǎn)期療效并不理想，并可能會發(fā)生并發(fā)癥。
　　 近年來，以修復(fù)椎間盤退變恢復(fù)椎間盤高度為目的的組織工程技術(shù)和細(xì)胞治療技術(shù)逐漸被認(rèn)為是具有前景的治療方法。然而，無論是組織工程技術(shù)還是細(xì)胞治療技術(shù)，在椎間盤退變性疾病的治療中尚缺乏理想的種子細(xì)胞。本實驗探討人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞（Wharton’s jelly-derived mesenchymAlstem

6、 cells, WJMSCs）向髓核細(xì)胞（nucleuspulposus cells, NPCs）的分化潛能，希望為椎間盤退變性疾病的治療提供一種理想的種子細(xì)胞來源。
　　 方法：取人正常足月產(chǎn)嬰兒臍帶，分離消化臍帶華通膠組織，收集培養(yǎng)華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞；取人正常未退變椎間盤（T12-L1），酶消化法分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞。取穩(wěn)定增殖的第3代華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。CFSE 標(biāo)記華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。使用帶有插入層的Tr

7、answell 培養(yǎng)板進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)，插入層具有0.4μm 高密度孔徑；下層接種華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，上層接種髓核細(xì)胞。普通六孔板進(jìn)行接觸式共培養(yǎng)。根據(jù)共培養(yǎng)細(xì)胞比例不同分為3組（25:75 WJMSCs/hNPCs，50:50WJMSCs/hNPCs，75:25 WJMSCs/hNPCs），于共培養(yǎng)1周后，利用MoFlo 高速流式細(xì)胞分選儀分選收集接觸式共培養(yǎng)的華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。提取華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDN

8、A，利用Real-Time PCR 方法檢測其蛋白多糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、VI 型膠原、SOX-9及多能聚糖等基因表達(dá)，管家基因GAPDH作為內(nèi)參，單獨培養(yǎng)的華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照，利用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：細(xì)胞分選點陣圖顯示CFSE 標(biāo)記的WJMSCs與無熒光標(biāo)記的髓核細(xì)胞完全分離并分選。分選后細(xì)胞進(jìn)行Real-Time PCR 檢測華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞相對基因表達(dá)變化。經(jīng)過7天共培養(yǎng)，結(jié)果顯

9、示，接觸式共培養(yǎng)各組華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的SOX-9、Ⅱ型膠原和蛋白多糖相對表達(dá)都有顯著提高（P<0.05），其中25:75WJMSCs/hNPCs組上調(diào)幅度最大（SOX-9上調(diào)2429倍，Ⅱ型膠原上調(diào)9463倍，蛋白多糖上調(diào)5974倍）；非接觸式共培養(yǎng)組各組華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的SOX-9、Ⅱ型膠原和蛋白多糖相對表達(dá)也有顯著提高（P<0.05），但基因上調(diào)幅度比接觸式共培養(yǎng)組?。≒<0.05），其中25:75 WJMSCs/hNPCs組基

10、因表達(dá)上調(diào)幅度最大（SOX-9上調(diào)114倍，Ⅱ型膠原上調(diào)57倍，蛋白多糖上調(diào)67倍）。共培養(yǎng)各組I 型膠原、VI 型膠原和多能聚糖的基因基因表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞具有向髓核細(xì)胞分化潛能。細(xì)胞共培養(yǎng)7天能夠誘導(dǎo)華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞，最優(yōu)細(xì)胞比例為25:75 WJMSCs/NPCs。
　　 接觸式共培養(yǎng)更有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，可推測華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植入