低氧對(duì)人髓核組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向類(lèi)髓核細(xì)胞分化的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人退變髓核組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)及鑒定人退變髓核組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（NP-MSCs）并觀察其生物學(xué)特性。方法：收集10例腰椎間盤(pán)退行性疾病患者的髓核手術(shù)標(biāo)本，采用0.05％II型膠原酶消化加貼壁法分離髓核間充質(zhì)干細(xì)胞并體外培養(yǎng)和擴(kuò)增。用倒置相差顯微鏡觀察人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表型分子、定向誘導(dǎo)人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨及成軟骨分化。結(jié)果：采用0.05％I

2、I型膠原酶37℃消化4小時(shí)（h）即可從組織標(biāo)本中分離出人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞。人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)3天可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，30天左右達(dá)到80％融合，傳至第3代后，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成均一的長(zhǎng)梭形或紡錘形，呈漩渦狀排列。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD29和CD105，不表達(dá)或低表達(dá)CD34、CD45及HLA-DR。多向誘導(dǎo)21天（d）后，成骨誘導(dǎo)組Alizareen染色和成軟骨誘導(dǎo)組Safranin’O染色呈陽(yáng)性，成脂誘導(dǎo)組油紅O染色陰

3、性。結(jié)論：采用0.05%II型膠原酶消化結(jié)合貼壁法可從人退變髓核組織中提取具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　第二部分低氧對(duì)人髓核組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向類(lèi)髓核細(xì)胞分化的生物學(xué)誘導(dǎo)效應(yīng)
　　目的：探索低氧對(duì)人退變髓核組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（NP-MSCs）向類(lèi)髓核細(xì)胞定向分化的生物學(xué)效應(yīng)。方法：在5%氧濃度下，用含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3（TGF-β3）誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立在21%氧濃度下誘導(dǎo)培養(yǎng)為對(duì)照組。誘

4、導(dǎo)培養(yǎng)第7天（d）和14d，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Realtime-PCR）檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α)、SOX-9、Aggrecan和II型膠原基因的表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)1采4d用，獨(dú)采立用樣免本疫熒光法檢測(cè)低氧誘導(dǎo)組與常氧誘導(dǎo)組細(xì)胞II型膠原的表達(dá)。組間比較t檢驗(yàn)。結(jié)果：NP-MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第7d時(shí)低氧組HIF-1α與SOX-9基因的相對(duì)表達(dá)量高于常氧組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但 Aggrecan和 II型膠原基