三維共培養(yǎng)兔髓核細胞誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：平面及三維培養(yǎng)髓核細胞的生物學特性
　　 目的：運用藻酸鈉微球(alginate beads)培養(yǎng)法和平面培養(yǎng)法對兔椎間盤髓核細胞進行體外培養(yǎng)，研究其體外生物學特性。
　　 方法：4月齡健康新西蘭大耳白兔6只，取髓核細胞(nucleus pulposus cells，NPCs)原代培養(yǎng)，傳代后分為藻酸鈉微球培養(yǎng)組（實驗組）和平面培養(yǎng)組（對照組），通過倒置相差顯微鏡對髓核細胞進行

2、形態(tài)學觀察，MTT法測定兩組髓核細胞增殖情況，運用RT－PCR技術(shù)檢測兩組髓核細胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達。
　　 結(jié)果：經(jīng)過兩周的培養(yǎng)，兩組髓核細胞增殖率無明顯差異，藻酸鈉微球培養(yǎng)組在Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達上均高于平面培養(yǎng)組 (P<0.05)。
　　 結(jié)論：藻酸鈉微球培養(yǎng)法能促進髓核細胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達，在維持其表型穩(wěn)定方面優(yōu)于平面培養(yǎng)法。
　　 第二部分：體外誘導標記綠色熒光蛋白兔骨

3、髓間充質(zhì)干細胞分化成骨及成脂的實驗研究
　　 目的：綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記兔骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，觀察其誘導成骨及成脂多向分化的潛能。
　　 方法：取四月齡新西蘭大白兔6只，雌雄不限，實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。應用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法從兔股骨中分離、純化骨髓間充質(zhì)干細胞并在體外進行培養(yǎng)，以形態(tài)

4、學及細胞表面標志的方法鑒定間充質(zhì)干細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征。用脂質(zhì)體介導法將綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。利用成骨誘導劑和成脂誘導劑誘導穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨及成脂方向分化，采用茜素紅染色及油紅O染色檢測MSCs分化的情況。
　　 結(jié)果：經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞多呈紡錘形或梭形，成纖維細胞樣，流式細胞儀分析MSCsCD44表達陽性，CD34表達陰性。標

5、記綠色熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導21 d后有較多的鈣鹽沉積，茜素紅染色呈紅色。成脂誘導3天后，細胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，2 周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅O染色顯示細胞含有豐富的脂肪顆粒。
　　 結(jié)論：通過密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法可大量擴增、純化MSCs，用脂質(zhì)體介導法將綠色熒光蛋白質(zhì)粒標記的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)后具有多向分化潛能。
　　 第三部分：三維共培養(yǎng)兔髓核細胞誘導骨髓

6、間充質(zhì)干細胞定向分化的實驗研究
　　 目的：研究髓核細胞(nucleus pulposus cells，NPCs)與骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在藻酸鹽微球構(gòu)建的三維環(huán)境下進行共培養(yǎng)時，髓核細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞的近距離接觸后骨髓間充質(zhì)干細胞表型的變化，為構(gòu)建組織工程髓核提供種子細胞建立基礎(chǔ)。
　　 方法；自健康新西蘭大耳白兔取髓核細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)；將傳代分離純

7、化的骨髓間充質(zhì)干細胞通過轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)進行標記并隨機分為實驗組與對照組；將轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞單獨培養(yǎng)（對照組）或以1：1的比例和髓核細胞于海藻酸鹽凝膠微球中進行共培養(yǎng)（實驗組）；共培養(yǎng)14天后，溶解海藻酸鹽凝膠珠，通過流式分選收集骨髓間充質(zhì)干細胞并分別利用RT－PCR技術(shù)和免疫組織化學技術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細胞中Ⅱ型膠原（II Collagen）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的表達。
　　 結(jié)果；實驗組骨髓間