體外誘導(dǎo)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向肝細(xì)胞分化.pdf

1、BMSCs作為組織工程的種子細(xì)胞具有較多優(yōu)勢(shì)，BMSCs是成體干細(xì)胞，來(lái)自患者自身，取材方便，有多向分化潛能，而干細(xì)胞替代病態(tài)的肝細(xì)胞已成為肝臟導(dǎo)向的細(xì)胞治療的主要目標(biāo)，對(duì)干細(xì)胞分化向肝細(xì)胞進(jìn)行深入的研究，有望給肝病治療帶來(lái)新的飛躍。 目的：⑴. 建立犬BMSCs體外培養(yǎng)體系，觀察BMSCs的形態(tài)、生長(zhǎng)特性及表面抗原的表達(dá)情況。⑵. 探討HGF、EGF對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化作用，探索出適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件，為進(jìn)一步深

2、入研究和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 材料和方法：⑴. BMSCs的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性分析：采用全血貼壁法對(duì)BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察BMSCs的形態(tài)及生長(zhǎng)特性。培養(yǎng)至第2代進(jìn)行檢測(cè)：細(xì)胞活力分析，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。⑵. BMSCs體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞及相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，依據(jù)培養(yǎng)液中所加生長(zhǎng)因子不同分為四組：無(wú)生長(zhǎng)因子組、EGF組、HGF組和HGF+EGF組，相應(yīng)標(biāo)記為A

3、、B、C、D四組，并于誘導(dǎo)后7d、14d、21d留取細(xì)胞，免疫組化檢測(cè)AFP、CK-18表達(dá)情況，免疫熒光檢測(cè)ALB表達(dá)，PAS反應(yīng)檢測(cè)糖原，RT-PCR分析ALB mRNA表達(dá)情況。⑶. 流式細(xì)胞技術(shù)分析誘導(dǎo)細(xì)胞的分化率并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：⑴. 細(xì)胞培養(yǎng)：接種7d后在倒置相差顯微鏡下觀察見(jiàn)原代BMSCs呈集落樣生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞散在分布，大小形態(tài)均一性好，細(xì)胞增殖旺盛。至第2代臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力可達(dá)98％左右。分離

4、的細(xì)胞表面CD標(biāo)記為：CD13－、CD34－、CD45－、CD29＋，均一性可達(dá)90％以上。MTT法繪制生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)第2代BMSCs有很強(qiáng)的增殖能力。⑵. 生物化學(xué)檢測(cè)：C、D組誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞均可檢測(cè)到肝系細(xì)胞的標(biāo)志，細(xì)胞誘導(dǎo)至7d時(shí)出現(xiàn)AFP表達(dá)，14d時(shí)表達(dá)增高，21d時(shí)表達(dá)下降；7d時(shí)可有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)CK-18，14d時(shí)ALB和糖原出現(xiàn)表達(dá)，且CK-18、ALB和糖原隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增高；3周時(shí)RT-PCR也可檢測(cè)到ALB m

5、RNA的表達(dá)；A、B組細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到肝系細(xì)胞標(biāo)志。⑶. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：21d時(shí)熒光標(biāo)記誘導(dǎo)細(xì)胞ALB后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞分化率，對(duì)各組誘導(dǎo)率進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明：D組誘導(dǎo)率明顯高于C組（P<0.05）。 結(jié)論：⑴. 采用全血貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖力旺盛，而且具有較高的活力和純度。⑵. HGF和EGF體外可以誘導(dǎo)BMSCs定向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化，而且二者有協(xié)同作用。⑶. 單獨(dú)EGF無(wú)誘導(dǎo)BMSCs定向肝細(xì)胞