Brg1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化肝細(xì)胞.pdf

1、第一部分小鼠Brg1慢病毒干擾載體構(gòu)建及驗(yàn)證
　　 目的:構(gòu)建小鼠Brg1(Brahma-related gene1)特異性shRNA慢病毒載體并檢測其對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)中Brg1的沉默效應(yīng)。方法:針對小鼠Brg1 mRNA序列，設(shè)計(jì)合成3對短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列，退火形成雙鏈后連入PLL3.7載體;經(jīng)酶切和測序鑒定后，將重組慢病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

2、，包裝得到病毒顆粒并檢測其滴度。將病毒液以感染復(fù)數(shù)(MOI)為5、15和30分別感染BM-MSCs，72h后計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。將3種病毒液以最佳MOI感染BM-MSCs，同時(shí)設(shè)未感染病毒的正常對照(Control)組和感染空載體病毒的陰性對照(GFP)組，72h后Real time PCR檢測Brg1 mRNA水平變化，計(jì)算抑制效率得出最佳干擾序列。結(jié)果:雙酶切及測序結(jié)果證實(shí)干擾序列插入正確，MOI為15時(shí)對BM-MSCs轉(zhuǎn)染效率最高(90

3、％)，且細(xì)胞狀態(tài)好;與GFP組相比，Brg1-shRNA2干擾效率為82.35％，沉默效果最佳。結(jié)論:構(gòu)建的小鼠Brg1-shRNA慢病毒載體能有效降低BM-MSCs中Brg1 mRNA水平，為進(jìn)一步研究其在BM-MSCs定向分化肝細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分 Brg1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化
　　 目的:了解Brg1在BM-MSCs定向分化肝細(xì)胞中的作用。方法:全骨髓差異貼壁法分離培養(yǎng)獲得P3-P6

4、代BM-MSCs，添加HGF、FGF4培養(yǎng)7d后，Realtime PCR和Western blot檢測Brg1、AFP和Foxa2表達(dá)水平，ChIP檢測AFP、Foxa2基因啟動(dòng)子區(qū)Brg1招募水平，以未誘導(dǎo)0d組為對照。將Brg1慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染BM-MSCs，并設(shè)空白對照(Control)組和陰性對照(Lv-GFP)組培養(yǎng)24h，換液后添加HGF、FGF4進(jìn)行培養(yǎng)，7d后檢測各組Brg1、AFP和Foxa2表達(dá)水平及AFP和Fo