大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為類肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 目前，肝炎、感染、創(chuàng)傷、腫瘤等引起的晚期終末肝衰竭的患者越來越多，對于肝衰竭或肝功能支持替代方法成為臨床的一大難題。現(xiàn)在的臨床治療方法包括肝臟移植、肝細(xì)胞移植、肝臟干細(xì)胞移植。其中原位肝移植是治療急性肝功能衰竭、終末期肝病、代謝性肝病最為有效的方法，但是由于其供體來源極其有限，技術(shù)要求高，經(jīng)濟(jì)費(fèi)用大，很難滿足眾多患者需要，許多患者在痛苦的等待中死亡。肝細(xì)胞移植也開展了數(shù)十年，其操作簡單，價(jià)格便宜，曾經(jīng)頗為流行，但由于其

2、供體缺乏和免疫排斥反應(yīng)問題而影響到進(jìn)一步的發(fā)展。肝臟干細(xì)胞是近幾年研究的熱點(diǎn)，由于其來源于自體而沒有移植后的免疫排斥反應(yīng)，是合適的肝臟損傷后肝衰竭的移植物并有望成為一種新的臨床方法。但經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，肝臟本身干細(xì)胞的數(shù)量極其微少，并且其在體外增殖較為困難，限制了這個(gè)研究的發(fā)展前景。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCs)在一定條件下可以定向分化成為某種成體干細(xì)胞、成體細(xì)胞或者橫向

3、分化為多種組織細(xì)胞的潛力被證實(shí)了，因而備受人們關(guān)注，又有研究發(fā)現(xiàn)：它可能是肝臟干細(xì)胞的來源之一，也有證據(jù)表明MSCs在肝臟損傷的修復(fù)中起到非常重要的作用。在此過程中，MSCs的分離、培養(yǎng)和性質(zhì)鑒定等方面的研究取得了一定進(jìn)展。骨髓干細(xì)胞是成體干細(xì)胞中的主要來源部分，它主要由間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞組成。造血干細(xì)胞在胚胎早期具有分化成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的潛能，以后進(jìn)一步分化為血系細(xì)胞、肌、肝、肺、腎、小腸、皮膚等。它主要存在于骨髓、外周血和

4、臍帶血中，可分化為各種血細(xì)胞使血液細(xì)胞成分得到不斷補(bǔ)充，是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一來源。臨床上，造血干細(xì)胞移植技術(shù)已經(jīng)成為治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病、多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。伴隨造血干細(xì)胞的研究進(jìn)展，MSCs是最近幾年被發(fā)現(xiàn)的，它可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)元等。由于MSCs可以向多個(gè)胚層、各種組織細(xì)胞分化，并且可以通過溫和的機(jī)械方法獲得，故研究其分離培養(yǎng)的方法、進(jìn)行分化調(diào)控，以及培養(yǎng)成

5、為肝細(xì)胞具有發(fā)展前景，因此它能否最終解決肝臟損傷后肝衰竭的移植物問題成為近來的熱點(diǎn)． 研究目的 本實(shí)驗(yàn)旨在探討一種操作簡單、費(fèi)用低廉、結(jié)果可靠的大鼠MSCs分離培養(yǎng)方法，為體外增殖提供一種可行的途徑。對分離的大鼠MSCs進(jìn)行體外多細(xì)胞因子調(diào)控，促使其向有功能的肝細(xì)胞分化。對肝損傷模型進(jìn)行經(jīng)過誘導(dǎo)的MSCs同種大鼠移植，觀察其對損傷肝臟可能的修復(fù)作用、探討修改機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)研究意義：各種原因引起的肝炎、肝硬化及肝癌

6、等肝臟損傷疾病的治療一直是一個(gè)全球性難題，骨髓干細(xì)胞移植治療血液系統(tǒng)疾病已積累了幾十年的臨床經(jīng)驗(yàn)，而其作為肝基因治療的細(xì)胞載體具有肝細(xì)胞不可替代的優(yōu)勢，不僅在于可以替代肝細(xì)胞移植，而且還可以在早期即可利用骨髓修復(fù)肝臟損傷，并為干細(xì)胞工程、肝組織工程提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。隨著人們對MSCs橫向分化機(jī)制認(rèn)識的逐步深入，MSCs將替代成熟肝細(xì)胞而成為肝細(xì)胞移植或體外人工肝臟的一種新來源，將為以上各種原因引起的肝損傷開拓新的治療途徑。

7、 研究方法 1.直接貼壁法分離純化MSCs，進(jìn)行體外傳代，用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其性質(zhì)，用核染技術(shù)研究其DAPI和BrdU的標(biāo)記，流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。 2.HGF聯(lián)合EGF對體外培養(yǎng)的MSCs誘導(dǎo)分化，用倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、透射和掃描電鏡形態(tài)學(xué)照相，細(xì)胞免疫組化、RT-PCR對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。檢測誘導(dǎo)分化后MSCs分泌尿素及攝取靛青綠的功能。 3.制造大鼠肝損傷模型，Brd

8、U標(biāo)記上述誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的MSCs，經(jīng)門靜脈移植至同種D-氨基半乳糖損傷的大鼠，通過血生化檢測受體肝功能，組織學(xué)、組織免疫組化、組織電鏡等方法對移植后的MSCs追蹤，評估肝臟修復(fù)情況。 上述方法具體內(nèi)容和過程如下： 1.MSCs分離和鑒定：無菌條件下取大鼠股骨、脛骨，用改良沖洗法抽出骨髓，用直接貼壁法分離純化MSCs，體外擴(kuò)增、傳代。取第3代行細(xì)胞爬片，用抗CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD14、C

9、D34、CD45行免疫細(xì)胞化學(xué)檢查，同時(shí)流式細(xì)胞技術(shù)鑒定它們的定量表達(dá)。DAPI和BrdU對分離的MSCs標(biāo)記，流式細(xì)胞技術(shù)對分離的MSCs行周期檢測。 2.誘導(dǎo)MSCs與鑒定：取上述第3代的MSCs，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組按照實(shí)驗(yàn)第一部分獲得大鼠MSCs，以細(xì)胞濃度2×105/ml，接種培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組為特級胎牛血清內(nèi)添加20ng/mlHGF+10ng/mlEGF培養(yǎng)誘導(dǎo)的MSCs。 3.肝臟損傷的修復(fù)：D一氨基半乳糖

10、腹腔注射復(fù)制大鼠肝臟損傷模型(400mg/kgD-gal,使大鼠的受到肝臟中等程度的損傷)，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組向損傷的大鼠門靜脈移植用BrdU標(biāo)記的HGF聯(lián)合EGF誘導(dǎo)后的MSCs培養(yǎng)液1ml(每毫升培養(yǎng)液中含細(xì)胞數(shù)105)，對照組用BrdU標(biāo)記的未誘導(dǎo)MSCs同濃度劑量對模型行門靜脈移植，分別在1、3、7、14天進(jìn)行抽血查生化(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、總膽紅素TBi)、切片行常規(guī)病理、組織免疫組化法檢

11、測CK18、CD34、OV6、BrdU陽性細(xì)胞分布遷移情況、透射電鏡觀察移植后匯管區(qū)新增生細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，評價(jià)類肝細(xì)胞在體內(nèi)移植及修復(fù)肝功能結(jié)果。 研究結(jié)果 1.體外培養(yǎng)的原代MSCs72小時(shí)內(nèi)可見貼壁細(xì)胞，7天左右達(dá)到匯合，傳代后，細(xì)胞免疫組化法顯示MSCs的CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表達(dá)陽性，流式細(xì)胞儀檢測其陽性率分別為64.36％、86.73％、90.21％、74.25％、54.60％；而C

12、D14、CD34、CD45表達(dá)陰性，陽性率分別為0.19％、0.17％、0.18％。DAPI標(biāo)記效率高達(dá)100％，BrdU標(biāo)記率達(dá)98％以上，均是較好的標(biāo)記方法。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示：第3代MSCs中G0/G1期的細(xì)胞為89.43％(大約為36-57道)，G2期的細(xì)胞為2.82％(大約在兩倍道86-112道)，S期的細(xì)胞為7.65％。只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期，大部分細(xì)胞處于靜止期，符合干細(xì)胞特征。 2.HGF聯(lián)合EGF對體外

13、培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化：倒置相差顯微鏡觀察顯示：實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs逐漸向類肝細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，由剛開始的梭型，變?yōu)闄E圓型、類圓形，增殖速度減慢，而對照組細(xì)胞的形態(tài)基本不變。細(xì)胞免疫組化鑒定：Alb和AFP蛋白染色，與對照組陰性結(jié)果比較，實(shí)驗(yàn)組Alb第3天即呈陽性表達(dá)，AFP蛋白染色第7天陽性表達(dá)。顯微熒光觀察：實(shí)驗(yàn)組MSCs的FITC-AFP為綠色熒光，RPE-Alb為紅色熒光。RT-PCR檢測：與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組MSCs細(xì)胞的

14、Alb、AFP、CK-18的mRNA都有一定表達(dá)，其中AFP的mRNA在第7天陽性表達(dá)，14天最強(qiáng)，21天開始減弱，Alb及CK-18第三天即有表達(dá)，21天均最強(qiáng)。透射電鏡顯示：未誘導(dǎo)MSCs具有幼稚細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 3.誘導(dǎo)MSCs經(jīng)門靜脈移植修復(fù)肝臟結(jié)果：分別于1、3、7、14天處死大鼠，ALT、AST、TBi三項(xiàng)肝功指標(biāo)均明顯異常，兩組均出現(xiàn)逐步下降的趨勢(實(shí)驗(yàn)組/對照組：ALT：335.67±15.08→45.20±5.

15、89/347.67±22.26→78.00±2.16IU/L。AST：265.33±15.37→45.00±6.04/267.83±8.80→77.25±6.99IU/L。TBi：7.18±0.37→3.45±0.18/7.60±0.49→4.81±0.23mol/L)，但在同時(shí)間段內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組下降幅度更大。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三項(xiàng)指標(biāo)在兩組間有顯著差異(F=206.84，P=0.000)，同組內(nèi)不同時(shí)間之間有顯著差異(F=14.289,P=

16、0.000)。說明實(shí)驗(yàn)組與對照組對于肝臟功能的保護(hù)作用是有差異的，證明了誘導(dǎo)分化的類肝細(xì)胞具有修復(fù)肝臟功能的作用。組織切片顯示：實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞變性壞死程度明顯輕于對照組，尤以7、14天更明顯，免疫組化示BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨時(shí)間延長，逐漸由門脈區(qū)向肝內(nèi)移動(dòng)，組織免疫組化檢測：兩組均出現(xiàn)CK18、CD34、OV6陽性細(xì)胞結(jié)果；與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞明顯增多，形成大量的膽小管，并有部分向壞死區(qū)遷移。透射電鏡顯示：與對照組比較，

17、實(shí)驗(yàn)組有新生內(nèi)源性細(xì)胞，小于成熟的肝細(xì)胞，細(xì)胞器較少，有細(xì)胞緊密連接，以數(shù)個(gè)細(xì)胞排列成小膽管，與組織免疫化學(xué)檢查結(jié)果一致。 研究結(jié)論 1.本實(shí)驗(yàn)表明直接貼壁法分離MSCs簡單、易行，對分離的MSCs活性影響較小，值得推廣。MSCs能在體外較容易分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，為體內(nèi)、外研究MSCs提供了很好的來源。BrdU和DAPI標(biāo)記MSCs敏感性均好，標(biāo)記效率高，可作為標(biāo)記細(xì)胞的一種有效手段，為細(xì)胞移植打下良好的基礎(chǔ)。 2.

18、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HGF聯(lián)合EGF可以誘導(dǎo)MSCs在體外向類肝細(xì)胞分化，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的時(shí)間段第7天，可檢測到肝細(xì)胞標(biāo)志物和功能表達(dá)；形態(tài)上在21天更成熟，成為類肝細(xì)胞，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、糖原顆粒。 3.本實(shí)驗(yàn)將HGF聯(lián)合EGF誘導(dǎo)后的MSCs移植給受損傷的肝臟，發(fā)現(xiàn)其能在一定程度上修復(fù)肝臟的損傷，并能激發(fā)內(nèi)源性的卵圓細(xì)胞增生，協(xié)同恢復(fù)損傷的肝功能。對于肝移植、肝細(xì)胞移植、肝臟干細(xì)胞移植方法上的不足和缺陷，可能會對各種原因的肝損傷患者