非黏附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文將在此理論基礎(chǔ)上通過反復(fù)轉(zhuǎn)移的非黏附細(xì)胞培養(yǎng)法分離小鼠骨髓中的非黏附間充質(zhì)干細(xì)胞；觀察表皮生長因子對(duì)非黏附間充質(zhì)干細(xì)胞克隆形成效率的調(diào)節(jié)作用；并深入探討非黏附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外、體內(nèi)尤其是缺血損傷的微環(huán)境中分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，為這些細(xì)胞進(jìn)一步用于細(xì)胞移植治療相關(guān)疾病提供技術(shù)參數(shù)。 第一部分:小鼠非黏附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定以及表皮生長因子對(duì)其克隆形成效率的影響 目的：分離培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓中的非黏附間

2、充質(zhì)干細(xì)胞( Non-adhaerent Bone-Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，NA-BM-MSC)；觀察表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)對(duì)NA-BM-MSC產(chǎn)生成纖維細(xì)胞集落形成單位(colony-formingunits-fibroblast，CFU-F)效率的影響。 方法：分離小鼠總骨髓細(xì)胞，分兩組體外培養(yǎng)，一組在總骨髓細(xì)胞中加入10ng

3、/mL的EGF，另一組為對(duì)照組，每天轉(zhuǎn)移未貼壁的非黏附骨髓細(xì)胞(Non-adherent Bone Marrow Cells,NA-BMC)到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每組中各皿細(xì)胞長滿12天后，亞甲基藍(lán)染色顯示形成的克隆，計(jì)數(shù)克隆個(gè)數(shù)；在總骨髓細(xì)胞培養(yǎng)到第四天時(shí)收集未貼壁的NA-BMC到新的培養(yǎng)血中，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)融合后傳代純化，取第四代細(xì)胞接種于向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液中，2周后分別進(jìn)行油紅染色、抗Ⅱ型膠原的免疫

4、組織化學(xué)染色以及茜素紅染色檢測(cè)脂肪滴、Ⅱ型膠原和鈣化結(jié)節(jié)的形成和表達(dá)情況；流式細(xì)胞檢測(cè)表面標(biāo)記物的表達(dá)。 結(jié)論：小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)過程中，24小時(shí)內(nèi)未貼壁的NA-BMC轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)能夠重新貼壁并形成CFU-F，并且NA-BMC所形成的克隆具有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的能力，具備了干細(xì)胞自我復(fù)制更新和多分化潛能的兩大特性，并表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，因此稱其為非黏附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(NA-BM-MSC)。E

5、GF能有效促進(jìn)NA-BM-MSC的增殖，進(jìn)一步提高了該細(xì)胞的富集效率。 第二部分:非黏附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討骨髓中存在的NA-BM-MSC在體外向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。 方法：分離小鼠骨髓總細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，于第四天收集未貼壁的NA-BMC到新的培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合后傳代純化，取第四代細(xì)胞用于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞按照1X103/Cm2的密度接種于預(yù)置蓋玻片的六孔板中，細(xì)胞貼壁

6、后，更換培養(yǎng)液為含20ng/ml的EGF和20ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子-2(b-FGF)的誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，2周后，甲苯胺藍(lán)染色和抗神經(jīng)細(xì)胞特異性核蛋白、抗神經(jīng)中間絲蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：NA-BM-MSC在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，為下一步用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究提供了保證。 第三部分:非黏附骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血損傷腦內(nèi)向神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討骨

7、髓非黏附間充質(zhì)干細(xì)胞(non-adherent bone marrow mesenchymal stem cells，NA-BM-MSC)在缺血損傷的腦內(nèi)存活以及向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。 方法：從β-Gal轉(zhuǎn)基因小鼠分離總骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)到第四天時(shí)，收集未貼壁的NA-BMC到新的培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，貼壁增殖，待生長到融合時(shí)傳代純化，取第4代NA-BM-MSC定向移植到小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血模型腦內(nèi)，8周后LacZ組織化學(xué)染色和免疫

8、組織化學(xué)染色法觀察供體細(xì)胞在缺血腦內(nèi)微環(huán)境中的存活情況以及神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。 結(jié)論：小鼠骨髓內(nèi)的NA-BM-MSC在缺血損傷的腦內(nèi)能夠存活、遷移，部分細(xì)胞還能分化為成熟的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與腦損傷的修復(fù)，為下一步作為種子細(xì)胞用于移植修復(fù)實(shí)驗(yàn)提供了保證。 本課題的特征和創(chuàng)新之處在于： 通過反復(fù)轉(zhuǎn)移的非黏附細(xì)胞培養(yǎng)法成功分離出非黏附的骨髓細(xì)胞，并通過克隆