電刺激誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞作用的研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷和脊髓損傷是骨科最常見的神經(jīng)損傷性疾病，具有發(fā)生率高、損傷程度重、修復效果差、致殘率高、治療費用高等特點?！爸亟ńY(jié)構(gòu)連續(xù)性和加快神經(jīng)生長速度”是國際公認的神經(jīng)損傷修復的關(guān)鍵，但這些問題至今尚未得到有效解決。組織工程細胞移植技術(shù)為神經(jīng)再生及修復帶來了希望，但由于取材來源有限和引發(fā)免疫排斥反應等問題，其應用受到限制。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度自我更新能力和多向分化潛能，可被誘導分化為神經(jīng)細胞，被認為是理想的組織工程種子

2、細胞。目前常用的化學誘導劑誘導法，易對細胞造成毒性損傷，導致誘導后細胞存活時間縮短、功能下降，無法滿足移植需求。因此，亟需尋找一種安全、有效的誘導分化方法。
　　電刺激在神經(jīng)損傷修復中的應用日益增加。有研究表明，電刺激可誘導脂肪干細胞分化成成骨細胞，并可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化，提示電刺激可干預干細胞的分化行為。但至今為止，有關(guān)電刺激對骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為神經(jīng)細胞的研究未見報道。因此，研究其有效性和可行的實施方法，

3、對于構(gòu)建組織工程種子細胞、促進神經(jīng)損傷修復具有重要意義。
　　本課題擬采用電刺激這一物理方法誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化，在篩選并確定適宜電刺激參數(shù)的基礎(chǔ)上，從細胞形態(tài)、細胞增殖能力、細胞凋亡情況、細胞分化等多個方面進行系統(tǒng)研究，為構(gòu)建組織工程種子細胞、促進神經(jīng)損傷修復提供新的思路。具體內(nèi)容如下：
　　第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：分離培養(yǎng)并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，采用形態(tài)學觀察、流式細胞技

4、術(shù)和誘導分化成骨實驗進行骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定。
　　方法：應用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法培養(yǎng)純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；CCK-8法檢測不同代數(shù)細胞的增殖能力；流式細胞技術(shù)檢測CD29、CD90、CD45表達情況；使用成骨誘導培養(yǎng)基誘導P3代BMSCs成骨分化，明確其分化能力。
　　結(jié)果：應用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法，成功培養(yǎng)出生長狀態(tài)較好的BMSCs，CCK-8法檢測顯示細胞增殖能力良好。培養(yǎng)的細胞

5、經(jīng)流式細胞檢測，大部分細胞呈現(xiàn)CD29、CD90陽性，CD45陰性，證明本實驗所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。進一步計數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，CD29和CD90雙陽性、CD45陰性的細胞數(shù)占總培養(yǎng)細胞數(shù)的96.89％，說明本實驗獲得的細胞純度較高。采用常規(guī)化學法誘導培養(yǎng)細胞成骨分化實驗結(jié)果顯示，誘導后的細胞呈茜素紅、ALP染色陽性，證明所培養(yǎng)的細胞可被誘導分化為成骨細胞，具有良好的分化潛能。
　　結(jié)論：通過細胞增殖能力檢測、流式細胞鑒定以及成

6、骨誘導分化實驗證實，本實驗所采用的全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法，可穩(wěn)定獲得活性良好、具有自我更新能力和分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞，可為后續(xù)研究提供充足的細胞來源。
　　第二部分：電刺激對于骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化過程的作用研究
　　目的：采用電刺激誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化，探索誘導分化的最適電刺激參數(shù)，初步闡明電刺激對骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為神經(jīng)細胞的作用，為應用種子細胞移植修復神經(jīng)損傷提供新方法。
　　方法：（1

7、）應用直流電刺激，選取不同刺激時間（A：15min/d、B：30min/d、C：1h/d、D：2h/d、E：空白對照）和不同電壓（A：1V、B：3V、C：5V、D：10V、E：空白對照），對骨髓間充質(zhì)干細胞進行干預，CCK-8法檢測細胞增殖情況變化，流式細胞技術(shù)檢測電刺激對細胞凋亡的影響，篩選最適宜的電刺激參數(shù)。（2）采用篩選出的適宜電刺激參數(shù)進行誘導分化研究。分別設(shè)立電刺激誘導組、化學誘導組、復合誘導組和空白對照組，MAP-2免疫熒光

8、染色鑒定細胞誘導分化情況，并計算誘導分化比率。
　　結(jié)果：(1)刺激時間篩選實驗結(jié)果表明，當電壓設(shè)定為3V時，采用刺激時間為30min/d（B組）的參數(shù)刺激后，細胞形態(tài)及數(shù)量均明顯優(yōu)于其余各組；細胞增殖能力較其余各組明顯提高，且差異具有統(tǒng)計學意義；細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)該參數(shù)的電刺激未明顯增加細胞凋亡。刺激電壓篩選實驗結(jié)果表明，當刺激時間為30min/d，采用刺激電壓為3V（B組）的參數(shù)刺激后，細胞形態(tài)及數(shù)量優(yōu)于其他各組，細胞增殖能力明

9、顯提高，且差異具有統(tǒng)計學意義；細胞凋亡檢測表明該參數(shù)的電刺激未明顯增加細胞凋亡。從而確定了3V、30min/d為適宜電刺激參數(shù)。(2)應用常規(guī)化學誘導法作為陽性對照，對BMSCs進行化學誘導，通過誘導率和免疫熒光染色結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)電刺激誘導組與化學誘導組，均可誘導BMSCs分化為神經(jīng)元，統(tǒng)計學無顯著差異（P＞0.05）；而復合誘導組的誘導率，優(yōu)于電刺激誘導組和化學誘導組，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。但復合誘導組和化學誘導組，在細

10、胞誘導成功后，出現(xiàn)細胞破裂、崩解及細胞殘片，而電刺激組未見此現(xiàn)象。
　　結(jié)論：通過對不同刺激時間和不同電壓參數(shù)進行篩選，確定3V，30min/d，連續(xù)刺激2d為適宜電刺激參數(shù)，應用于骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為神經(jīng)細胞實驗，研究結(jié)果表明，電刺激不僅可達到與化學誘導劑相同的誘導分化效果，而且毒性及損傷作用小，可更加安全有效的對骨髓間充質(zhì)干細胞發(fā)揮誘導分化作用。本實驗為應用電刺激干預干細胞提供實驗依據(jù)，為組織工程種子細胞的構(gòu)建提供了新的