骨髓間充質干細胞誘導分化為血管內皮樣細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討體外誘導人骨髓間充質干細胞(MSCs)分化為血管內皮樣細胞的可行性，并通過動物實驗觀察誘導培養(yǎng)的MSCs是否參與創(chuàng)面血管形成。 方法：取臨床檢查無嚴重疾病的病人骨髓2ml，密度梯度離心結合貼壁法分離MSCs，體外培養(yǎng)并傳代，行形態(tài)學觀察、掃描電鏡、透射電鏡、流式細胞儀和免疫細胞化學檢測。用L4(23)正交實驗篩選誘導因子VEGF、bFGF，據(jù)實驗結果選擇誘導因子組合，誘導培養(yǎng)MSCs，行細胞形態(tài)學觀察、透射電鏡、掃描電

2、鏡和免疫細胞化學檢測。取誘導培養(yǎng)的MSCs，經5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)標記，與膠原蛋白海綿支架復合構建組織工程真皮替代物，移植修復全層皮膚缺損創(chuàng)面，術后14天行創(chuàng)面組織切片免疫組織化學染色。 結果：經密度梯度離心結合貼壁法獲得的MSCs，外觀呈長梭形或紡錘形，掃描電鏡示其細胞表面有短而粗的微絨毛突起，細胞周圍存在薄紗樣的細胞基質，透射電鏡示細胞存在兩種不同的形態(tài)結構，分別與細胞所處的兩種功能狀態(tài)相對應。流式細胞儀示大部分

3、MSCs處于相對靜息期，G0+G1期的細胞達85.35％，免疫細胞化學示MSCs細胞表面抗原CD29、CD44染色陽性，CD34、CD45、Ⅷ因子染色陰性。VEGF誘導組、bFGF誘導組和VEGF+bFGF聯(lián)合誘導組的Ⅷ因子陽性率與MSCs組比較均有差異(P＜0.05)，以VEGF+bFGF聯(lián)合誘導組的差異最具顯著性(P＜0.01)。經VEGF、bFGF聯(lián)合誘導培養(yǎng)的MSCs，細胞外觀呈短梭形或扁圓形，掃描電鏡見細胞邊緣的微絨毛和細胞間

4、橋樣結構，透射電鏡示其胞質內含有內皮細胞特征性的WP小體，免疫細胞化學示MSCs細胞表面抗原CD34、Ⅷ因子染色陽性。經誘導培養(yǎng)的MSCs接種于膠原蛋白海綿支架后，細胞粘附良好。用其移植修復全層皮膚缺損創(chuàng)面，14天后見5-BrdU陽性細胞位于肉芽組織小血管周圍。 結論：經密度梯度離心結合貼壁法分離得到的MSCs具備干細胞的生物學特性；VEGF、bFGF均可在體外誘導MSCs分化為血管內皮樣細胞，VEGF比bFGF的誘導作用明顯，