人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的研究.pdf

1、瓣膜病在先天性心臟病的患兒中占有一定的比例,瓣膜置換術(shù)是此類(lèi)疾病的最終治療辦法?，F(xiàn)今用于臨床的瓣膜置換物有機(jī)械瓣和同種異體瓣膜兩大類(lèi)。雖然此兩種瓣膜在臨床研究上已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,但仍有很多問(wèn)題限制了兩者在臨床的長(zhǎng)期應(yīng)用。因此,對(duì)心臟瓣膜的組織工程學(xué)研究是心臟外科領(lǐng)域的重大課題。
　　 組織工程心臟瓣膜主要包括種子細(xì)胞的選擇、瓣膜支架的制備、體外的聯(lián)合培養(yǎng)以及在臨床上應(yīng)用的研究。種子細(xì)胞的選擇是瓣膜組織工程的首要問(wèn)題,也是研究

2、的熱點(diǎn)。以往的研究主要集中在自體血管的壁細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞,由于各自的缺陷,限制了其在研究中的應(yīng)用。如今研究較多的是各種干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,例如胚胎干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化；而骨髓干細(xì)胞以其容易獲取、多向分化、增殖迅速等優(yōu)點(diǎn)成為了當(dāng)今種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究利用人的骨髓血,采用密度梯度離心法獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和傳代,獲取純化的BMSCs。而后,在含有內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維

3、細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Bfgf)的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化,使BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞的方向分化。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制來(lái)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特有的表面標(biāo)記抗原CD31、CD34和Ⅷ因子。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明骨髓干細(xì)胞具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能,為其應(yīng)用于組織工程心臟瓣膜提供依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1研究對(duì)象
　　 骨髓血標(biāo)本來(lái)源于臨床心臟外科住院手術(shù)病人,無(wú)骨

4、髓造血性疾病,半年內(nèi)未進(jìn)行過(guò)放療或化療。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1骨髓血采集:
　　 在病人家屬及病人知情同意后,手術(shù)室內(nèi)取右側(cè)骼前上棘為穿刺點(diǎn),消毒鋪巾后,行骨髓穿刺術(shù),抽取骨髓血5ml。注射器預(yù)先用2ml濃肝素鈉濕潤(rùn),以便抗凝。在低溫下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,以保持細(xì)胞活力。并注意無(wú)菌操作以避免污染。
　　 2.2標(biāo)本制備:
　　 在無(wú)菌的條件下,利用密度梯度法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。之后接種于25m

5、l的培養(yǎng)瓶中,3天之后首次換液.直到細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿整個(gè)瓶底的80％-90％時(shí)進(jìn)行第一次傳代,以1:2-1:3的比例接種于培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞傳代至第3代時(shí),用含有VEGF、Bfgf的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化,換液時(shí)間和方法同前。在不同的時(shí)間對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察,記錄細(xì)胞形態(tài)的變化、繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 2.3實(shí)驗(yàn)測(cè)定:
　　 細(xì)胞誘導(dǎo)后大約20天時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),檢測(cè)內(nèi)容為CD31、CD34、Ⅷ因子(

6、內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)記抗原)。
　　 結(jié)果：
　　 1接種初期BMSCs形態(tài)是短梭形的,等細(xì)胞生長(zhǎng)一定的天數(shù)之后,細(xì)胞逐漸的增大成長(zhǎng)梭形或者是紡錘形。原代的細(xì)胞生長(zhǎng)成巢狀或者是旋渦狀,而傳代之后的細(xì)胞則成排列狀生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)和原代的相比變化不大。加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)天之后,細(xì)胞的形態(tài)逐漸的變短,漸漸的由梭形變化成為了不規(guī)則形態(tài),最終演變成了鋪路石樣,而這種細(xì)胞形態(tài)是內(nèi)皮細(xì)胞的特征性形態(tài)。
　　 2免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示

7、內(nèi)皮細(xì)胞的特征性抗原CD31、CD34、Ⅷ呈陽(yáng)性。
　　 3流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD31陽(yáng)性表達(dá)率為86.9％,Ⅷ因子陽(yáng)性表達(dá)率82.5％,CD31/Ⅷ雙陽(yáng)性率為70.9％。
　　 結(jié)論：
　　 1 BMSCs是一種具有多項(xiàng)分化能力的干細(xì)胞；
　　 2在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化；
　　 3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程心臟瓣膜理想的種子細(xì)胞。