骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)對脂多糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:膿毒癥常被定義為機(jī)體的廣泛炎癥，常表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征，死亡率居高不下。膿毒癥時，細(xì)菌的組成部分和大量的宿主衍生的介質(zhì)會使血管內(nèi)皮屏障損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制、活化異常和凋亡，引起組織水腫和器官功能障礙，是引起多器官功能不全和死亡的關(guān)鍵原因。新近研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)可以穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)缺血區(qū)血管的生成，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中極可能具有應(yīng)用價值。本項目通過體外實驗，從細(xì)胞治療

2、學(xué)角度探討B(tài)MSC對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，為BMSC在膿毒癥治療中的應(yīng)用提供理論支持。此外，通過調(diào)節(jié)TGF-β、Smad4的表達(dá)，從正反兩方面論證TGF-β/Smad4信號通路在BMSC保護(hù)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，更加深入認(rèn)識BMSC對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:體外分離ICR小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實驗一:觀察LPS刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖、活化

3、和凋亡的改變，了解LPS介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的時效和量效關(guān)系;LPS刺激后，以BMSC干預(yù)，觀察不同時間點血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化和凋亡的改變情況，探討B(tài)MSC對LPS介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。實驗二:以BMSC干預(yù)LPS刺激后的血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測TGF-β、Smad4蛋白和基因水平的表達(dá);采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)TGF-β和Smad4表達(dá)后，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化和凋亡的改變情況，從正反兩方面論證TGF-β/Smad4信號通路在B

4、MSC保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用:(1)與對照組相比，100ng/ml和1000ng/ml LPS作用24h或48h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力顯著減弱(P＜0.05或P＜0.01)，E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌增加(P＜0.05或P＜0.01)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增多(P＜0.05)。但是與100ng/ml組相比，1000ng/ml

5、組血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力，E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌，以及細(xì)胞凋亡均無顯著性變化。(2)與LPS組相比，BMSC作用12h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡以及E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌無顯著性變化(P＞0.05);在24和48h時間點，BMSC干預(yù)后，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性升高，細(xì)胞凋亡以及黏附分子E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌明顯減低(P＜0.05或P＜0.01)。

6、
　　2.TGF-β/Smad4信號通路在BMSC保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用:(1)與24h、48h時間點對照組相比，LPS刺激能夠顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01);(2)與同時間點LPS組相比，BMSC作用24h和48h能夠顯著提高上清液中TGF-β水平，此外血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4表達(dá)均顯著提高(P＜0.05或P＜0.01);(3)與同時間點BMSC組相比，阻斷BMSC細(xì)胞TGF-β表達(dá)后，上清液

7、中TGF-β水平和血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4表達(dá)均明顯下降，同時BMSC對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用顯著受抑(P＜0.05或P＜0.01)。(4)與同時間點BMSC組相比，阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4表達(dá)能夠顯著下調(diào)BMSC對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.LPS能夠劑量/時間依賴性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖減低、凋亡增加和活化，在膿毒癥致病過程中，這一項效應(yīng)可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮和組織器官損傷的重要