肝素在脂多糖誘導(dǎo)急性損傷大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的抗炎作用及其機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥是宿主的防御系統(tǒng)對(duì)入侵的病原微生物作出的過(guò)度炎癥反應(yīng),發(fā)病率30％-70％,是ICU患者最主要的死亡原因,發(fā)生膿毒癥的患者接近30％會(huì)發(fā)生器官功能障礙,其中肺臟是最早也是最容易受累的器官,ICU中膿毒癥患者超過(guò)50％會(huì)發(fā)生急性肺損傷(acute lung-mjury,ALI),發(fā)生ALI的膿毒癥患者死亡率增高。近年研究表明ALI與膿毒癥具有相似的病理生理過(guò)程:宿主防御反應(yīng)失控導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生,內(nèi)皮細(xì)胞損傷,凝血系統(tǒng)活化,纖溶受到抑

2、制以及纖維化的發(fā)生。2001年一項(xiàng)評(píng)價(jià)重癥感染患者應(yīng)用活化蛋白C(activated protein C,APC)療效的全球性研究結(jié)果表明治療組死亡率下降6.1％,是迄今唯一證實(shí)重癥感染患者應(yīng)用抗凝劑提高生存率的國(guó)際性研究,后期研究表明與APC復(fù)雜的抗凝、抗炎及抗凋亡作用有關(guān)。近年越來(lái)越多的證據(jù)表明炎癥與凝血之間存在廣泛的交叉對(duì)話,抗凝劑在治療ALI中具有積極作用。
　　 核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-

3、κB)作為一種核轉(zhuǎn)錄因子,負(fù)責(zé)200多種基因的轉(zhuǎn)錄,其中多種基因在膿毒癥中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌和細(xì)菌的成分如脂多糖可以通過(guò)多種信號(hào)途徑使NF-κB活化,導(dǎo)致促炎因子的表達(dá),如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,白細(xì)胞介素(intedeukin,IL)-1β,IL-6,IL-8,IL-12及IL-18,并進(jìn)一步活化NF-κB和其上游的信號(hào)分子,形成惡性循環(huán)使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大。因此,NF-κB在炎癥反應(yīng)過(guò)程中處

4、于核心位置。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)解下游蛋白質(zhì)表達(dá)及炎癥介質(zhì)生成中起到重要作用,其中p38 MAPK是MAPK家族成員之一,在炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡、發(fā)育、分化及腫瘤的發(fā)生等過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。
　　 目的：
　　 肝素是一種天然形成的氨基葡聚糖,作為一種有效的抗凝劑在臨床應(yīng)用已超過(guò)半個(gè)世紀(jì)的時(shí)間。在拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)指

5、南中推薦應(yīng)用300-500U/h的普通肝素或低分子量肝素預(yù)防深靜脈血栓形成。肝素的抗凝作用機(jī)制是提高了抗凝血酶的活性,從而強(qiáng)烈抑制凝血酶、活化的因子x的活性。近年來(lái),一系列臨床和基礎(chǔ)研究表明肝素除了其抗凝特性外,還可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。肝素抑制促炎因子的釋放,包括IL-1β,IL-6,TNF-α。肝素抑制缺血再灌注損傷中NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并通過(guò)增加一氧化氮和前列環(huán)素的生成減少了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。在高動(dòng)力性膿毒癥中,肝素改

6、善內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管反應(yīng)性。然而,其抗炎作用和器官保護(hù)機(jī)制迄今仍不清楚。因此,本研究中我們?cè)噲D探討肝素在急性肺損傷動(dòng)物模型中的抗炎作用,并對(duì)體外脂多糖刺激人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究,探討了不同濃度肝素的作用,從而在細(xì)胞水平探討肝素在膿毒癥中的作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 一、動(dòng)物模型
　　 48只健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠,體重200-250g,隨機(jī)分成四組:正常對(duì)照組(n=12)

7、、急性肺損傷組(n=12)、急性肺損傷應(yīng)用低劑量普通肝素組(n=12)、急性肺損傷應(yīng)用高劑量普通肝素組(n=12)。急性肺損傷組鼠尾靜脈注射脂多糖6mg/kg,兩個(gè)肝素組在注射脂多糖前15分鐘分別經(jīng)鼠尾靜脈注射普通肝素100U/kg和300U/kg,正常對(duì)照組經(jīng)鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。
　　 二、標(biāo)本的采集與處理
　　 各組于造模后6小時(shí)腹主動(dòng)脈剖開處死動(dòng)物,其中6只取左肺置于4％多聚甲醛中過(guò)夜,石蠟包埋,制作5gm組

8、織切片,用于形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)檢查;另外6只取左肺測(cè)定肺干濕重比,右肺下葉測(cè)定伊文思蘭通透性。
　　 三、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)于上海拜力生物技術(shù)公司。生長(zhǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1-2天換液一次,取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于檢測(cè)。
　　 四、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)組織水平
　　 1.肺臟組織形態(tài)學(xué)觀察:H-E染色
　

9、　 2.肺臟血管通透性測(cè)定:伊文思蘭(evans blue dyes,EBD)
　　 3.肺臟干濕重比測(cè)定
　　 4.免疫組織化學(xué)技術(shù):細(xì)胞因子、粘附分子及NF-κB在肺臟組織的表達(dá)
　　 (二)細(xì)胞水平
　　 1.MTT法測(cè)定細(xì)胞活力,檢測(cè)不同濃度肝素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 2.Real-time PCR法檢測(cè)肝素對(duì)細(xì)胞因子和粘附分子mRNA水平的影響
　　 3.Western Blo

10、t法檢測(cè)肝素對(duì)p38 MAPK磷酸化的影響
　　 4.Western-Blot法檢測(cè)肝素對(duì)NF-κB活性的影響
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,在計(jì)算機(jī)上用SPSS13.0軟件包處理,單因素多水平比較采用方差分析,兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、肺臟組織學(xué)研究
　　 (一)肺臟組織

11、病理改變
　　 急性肺損傷組炎癥反應(yīng)明顯,肺泡壁增厚,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),局部出血及血栓形成,肺泡塌陷,肺泡腔內(nèi)見到滲出液。肝素治療組肺臟結(jié)構(gòu)改變減少,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,高劑量肝素組作用更明顯。
　　 (二)肺臟干濕重比
　　 急性肺損傷組肺臟干濕重比明顯降低(0.224±0.02 vs.0.295±0.03,P＜0.01),肝素治療使肺臟干濕重比增加,與急性肺損傷組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(低劑量肝素組0.266±0.01

12、vs0.224±0.02,P＜0.05;高劑量肝素組0.273±0.01 vs.0.224±0.02,P＜0.05),但兩個(gè)肝素組間沒(méi)有差異。
　　 (三)肺臟血管通透性
　　 急性肺損傷組肺臟對(duì)EBD通透性增加(1.821±0.14 vs.0.723±0.16,P＜0.01),肝素治療減輕了肺血管的通透性,與急性肺損傷組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(低劑量肝素組1.362±0.17 vs.1.821±0.14,P＜0.05;高劑量

13、肝素組1.215±0.31 vs.1.821±0.14,P＜0.01),但兩個(gè)肝素組間沒(méi)有差異。。
　　 (四)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)炎癥介質(zhì)及NF-κB在肺臟內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)
　　 免疫組化顯示正常肺組織僅在細(xì)胞漿及細(xì)胞間質(zhì)有少量炎癥介質(zhì)的表達(dá),急性肺損傷組在炎性細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)均可見炎癥介質(zhì)的大量表達(dá),尤其IL-1β、ICAM-1、E-選擇素表達(dá)明顯,肝素治療組表達(dá)明顯減少,高劑量肝素組更明顯。
　　

14、 二、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 (一)肝素減少脂多糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響
　　 肝素濃度大于50U/ml降低細(xì)胞活力,本實(shí)驗(yàn)中使用的肝素濃度對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用;脂多糖使細(xì)胞活力下降,肝素減少了脂多糖對(duì)細(xì)胞活力的影響。
　　 (二)肝素減少炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá)
　　 脂多糖刺激下,細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6、ICAM-1、E-選擇素mRNA水平明顯增高,其中IL-1β、IL-6于2小時(shí)達(dá)到高峰(分別為52.82±

15、3.91,38.55±3.44),10U/ml肝素明顯降低其表達(dá)(29.98±0.65,22.05±2.55);LPS刺激使E-選擇素,ICAM-1mRNA水平于6小時(shí)達(dá)到高峰(26.42±2.11,10.86±0.32),10U/ml肝素明顯降低其表達(dá)(19.97±1.81,5.76±0.31),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (三)肝素對(duì)p38 MAPK磷酸化的影響
　　 脂多糖能刺激p38 MAPK發(fā)生磷

16、酸化,2小時(shí)最明顯,肝素減少p-p38 MAPK的表達(dá),以10U/ml作用明顯,6小時(shí)p38 MAPK表達(dá)及磷酸化均明顯減少。
　　 (四)肝素對(duì)NF-κB活化的影響
　　 脂多糖刺激IκB-α發(fā)生降解,其蛋白水平明顯下降,肝素抑制IκB-α的降解,2小時(shí)最明顯;脂多糖刺激2小時(shí)NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生活化,肝素逆轉(zhuǎn)了NF-κB的核移位。
　　 結(jié)論：
　　 1.脂多糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,產(chǎn)生炎癥因子和粘附