血管生成素-1對脂多糖誘導的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　 觀察血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonarymicovascularendothelialcells，PMVEC)炎癥及凋亡的影響，探討Ang-1的抗炎和抗凋亡作用及其對PMVEC的保護機制。
　　 方法:
　　 1．新生小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)、傳代、純化及鑒定。2．CCK

2、8法測不同濃度的LPS（0ng/ml(對照組)、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）及Ang-1（0ng/ml(對照組)、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）作用于小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞后對其增值能力的影響，以確定最佳干預濃度。3．將分離培養(yǎng)的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞隨機分為7組：(A)空白對照組；(B)LPS組；(C)LPS＋Ang-1組；(D)LPS＋Ang-1＋LY2940

3、02組；(E)Ang-1組；(F)LY294002組；(G)DMSO組。4．各組細胞藥物干預24小時后測定相關(guān)指標。ELISA法測各組細胞上清液中細胞因子IL-8、TNF-α的表達；流式細胞儀AnnexinV/PI法測各組細胞早期凋亡率；酶標儀檢測各組細胞凋亡基因Caspase-3活性；Westernblotting法測各組細胞PI3K、P-AKT蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1．倒置顯微鏡下PMVEC呈典型的鵝卵石

4、或鋪路石樣的形態(tài)學特征，免疫熒光法鑒定PMVEC的CD31抗原表達陽性。2．LPS終濃度為l00ng/ml時明顯抑制PMVEC增殖（OD值：0.56±0.14），與對照組(OD值：1.08±0.22)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；Ang-1終濃度為l00ng/ml時明顯促進PMVEC增值(OD值：1.44±0.28)，與對照組（OD值：1.07±0.24）相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3．LPS組IL-8、TNF-α

5、的表達、早期凋亡率、Capase-3酶活力單位分別為(780±22pg/ml、360±20pg/ml、13.00±0.58％、1.21±0.12)，與對照組(220±16pg/ml、50±14pg/ml、4.50±0.44%、0.30±0.09)比較明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）；LPS＋Ang-1組IL-8、TNF-α的表達、早期凋亡率、Capase-3酶活力單位分別為(450±17pg/ml、220±13pg/ml、

6、6.10±0.58%、0.59±0.13）與LPS組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；而Ang-1＋LPS＋LY294002組IL-8、TNF-α的表達與Ang-1＋LPS相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但早期凋亡率(10.3±0.50%)、Caspase-3酶活力單位(0.92±0.11)與Ang-1＋LPS組比較顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。LPS組中PI3K、P-AKT蛋白表達水平明顯低于對

7、照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Ang-1＋LPS組中PI3K、P-AKT蛋白表達水平較LPS組明顯上升(P＜0.05)；Ang-1＋LPS＋LY294002組與Ang-1＋LPS相比，PI3K、P-AKT蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05)；此外，LY294002組與對照組相比，明顯抑制了PI3K和P-AKT蛋白分子的表達(P＜0.05)；而Ang-1組與對照組相比，又明顯增加了PI3K和P-AKT蛋白分子的表達(P＜0.0

8、5)；而DMSO組，對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 LPS作用于PMVEC可誘導其發(fā)生炎性反應及凋亡損傷，Ang-1對LPS誘導的PMVEC具有抗炎及抗凋亡的保護作用。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路可能參與了Ang-1的保護作用，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路受到抑制或阻滯時，Ang-1對LPS誘導的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用有所降低。Ang-1可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路中的