氯化血紅素對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護作用.pdf

1、【目的】①建立大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法。②探討氯化血紅素(hemin)對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及可能機制，為臨床提供實驗依據(jù)。
　　【方法】1.選取體重約為150g-200g的健康SD雄性大鼠，無菌狀態(tài)下快速剪取大鼠肺組織，應(yīng)用肺組織顆粒貼壁法獲得PMVECs（pulmonarymicrovas-cularendothelialcells,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞），同時進(jìn)行大鼠肺微血管內(nèi)

2、皮細(xì)胞的原代以及傳代培養(yǎng)；通過倒置顯微鏡觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的外形及狀態(tài)，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。2.應(yīng)用H2O2構(gòu)建肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，并用氯化血紅素（hemin）與H2O2共同孵育肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。選用生長狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞，隨機分五組：1.正常對照組；2.200umol/lH2O2組；3.200umol/lH2O2+2.5umol/lhemin組；4.200umol/lH2O2+5umol/lhemin組；5

3、.200umol/lH2O2+10umol/lhemin組。在H2O2作用細(xì)胞前4小時加入不同濃度的hemin，隨后再加200umol/lH2O2孵育4小時，而后終止實驗收集各組細(xì)胞及上清液；3.采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞生長抑制率的變化，用化學(xué)比色法檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量；4.Western-blot檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞LC-3和Beclin-1的蛋白量，同時觀察不同濃度hemin對血紅素氧合酶1（HO-1

4、）表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　【結(jié)果】1.體外培養(yǎng)的大鼠PMVECs的形態(tài)呈圓形、多角形、橢圓形梭形等不規(guī)則形態(tài),形成單層緊密排列時呈典型的鋪路石樣或鵝卵石樣排列,免疫熒光檢測FITC標(biāo)記的Ⅷ相關(guān)抗體呈陽性，成功建立了PMVECs的原代培養(yǎng)方法；2.H2O2使內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，且成劑量依賴性，200umol/LH2O2使內(nèi)皮細(xì)胞活力下降50％，把200umol/lH2O2作為建模濃度；3與正常對照組相比，200umol/lH2O2組細(xì)胞

5、生長狀態(tài)較差，細(xì)胞活力減低，LDH釋放量增高，不同濃度hemin預(yù)處理后，可較大程度地逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)變化，并呈現(xiàn)劑量依賴性。4.與正常對照組相比，200umol/lH2O2組細(xì)胞LC-3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平明顯增高，不同濃度hemin預(yù)處理后可較大程度地減低LC-3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)量，與200umol/lH2O2組相比均具有顯著差異（P<0.05），并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。5.不同濃度組的Hemin均能使內(nèi)皮細(xì)胞H