黨參成分對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧-缺糖損傷的保護(hù)作用與機(jī)制.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 腦是人體對(duì)缺氧最為敏感的器官，腦組織缺血，將會(huì)導(dǎo)致局部腦組織及其功能的損害。微血管內(nèi)皮細(xì)胞是腦缺血性損害的重要靶點(diǎn)之一。微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障重要組成部分，缺血后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷直接導(dǎo)致血腦屏障破壞，引起腦血管通透性增高和血管源性腦水腫，并最終導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞損傷。近年來(lái)，有學(xué)者提出了“神經(jīng)血管單元”的概念。“神經(jīng)血管單元”由神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞三類主要細(xì)胞及位于它們周圍的維持大腦組織完整性的細(xì)胞外

2、基質(zhì)組成，在腦缺血后應(yīng)作為一個(gè)整體來(lái)綜合考慮。既往缺血性腦血管病的研究一直主要集中于神經(jīng)細(xì)胞，而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)注不夠。研究發(fā)現(xiàn)僅僅激活內(nèi)源性神經(jīng)再生的效果并不滿意，如果更加重視對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)，可能取得更好的臨床療效。所以，研究缺血后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制并尋找出行之有效的減輕損害的方法，對(duì)于缺血性腦血管病的預(yù)防及治療有重要的意義。 中風(fēng)病為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重大疾病之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療尚不理想。由于對(duì)缺血性中風(fēng)病急性期起關(guān)鍵作用的病理因

3、素和病理環(huán)節(jié)認(rèn)識(shí)不同，中醫(yī)治療多強(qiáng)調(diào)祛痰、調(diào)化瘀、痰瘀同治、調(diào)通腑、清熱解毒；多以祛邪為主要治則，忽略了對(duì)人體正氣的顧護(hù)。為此，本課題組提出了中風(fēng)病急性期的“扶正護(hù)腦”治則，主張?jiān)陟钚白o(hù)腦治療的同時(shí)及早采用扶正固本法則，顧護(hù)人體正氣，拓寬了缺血性中風(fēng)病急性期的中醫(yī)治療思路。在中風(fēng)病急性期采用“扶正護(hù)腦”治則及其治法方藥，符合仲景“未虛先防，已虛防變”的治療思想。 中藥黨參，為扶正固本、益氣類的臨床常用代表藥。既往臨床和實(shí)驗(yàn)研究證

4、實(shí)了桔梗科黨參及其成分有較好的腦保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)室以往研究證明黨參3種成分：黨參總皂苷、黨參皂苷L-1、黨參SFE提取物對(duì)大鼠腦神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/缺糖損傷具有顯著保護(hù)作用。本課題采用大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/缺糖模型模擬缺血損傷，以LDH、NO、SOD、MDA、細(xì)胞壞死率、凋亡率、凋亡蛋白酶活化等指標(biāo)評(píng)價(jià)確定黨參3種成分：黨參總皂苷、黨參皂苷L-1、黨參SFE提取物對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/缺糖損傷的影響，探討3種黨參成分對(duì)腦微血

5、管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/缺糖損傷的保護(hù)作用，并初步探索了其作用機(jī)制，為中風(fēng)病急性期“扶正護(hù)腦”治則和中藥黨參成分用于中風(fēng)病急性期臨床治療提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中醫(yī)藥治療中風(fēng)病急性期開(kāi)辟了一個(gè)新的思路。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.原代分離、純化、培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并采用形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)(Ⅷ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性)技術(shù)鑒定細(xì)胞。 2.通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同終濃度的黨參總皂苷、黨參皂苷L-1、黨參成分SFE提取物，分別

6、在正常培養(yǎng)狀態(tài)下對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，并確定各藥物的最佳濃度。 3.采用化學(xué)方法檢測(cè)缺氧/缺糖損傷細(xì)胞上清液LDH漏出率(常規(guī)生化學(xué)方法)、N0(硝酸還原酶法)和MDA的含量(硫代巴比妥酸法)以及SOD的活力(黃嘌呤氧化酶法)。 4.采用Hoechst 33342和PI雙染法熒光顯微鏡檢測(cè)缺氧/缺糖損傷后不同終濃度的不同黨參成分對(duì)細(xì)胞的凋亡率和壞死率的影響。 5.采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和圖象半定量分析技

7、術(shù)測(cè)定缺氧/缺糖損傷后不同終濃度的不同黨參成分對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的平均光密度。 6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS40.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。 結(jié)論: 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/缺糖模型能很好的模擬腦缺血損傷。缺氧/缺糖損傷能顯著提高細(xì)胞上清液LDH的漏出率、NO和MDA含量，同時(shí)能顯著降低SOD的活力；能夠顯著增加細(xì)胞的死亡率、凋亡率及凋亡蛋白酶Caspase-3的活性。而中藥黨參的有效成分

8、可以阻斷上述損傷機(jī)制，保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，減輕腦組織缺血/缺氧性的損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：①黨參總皂苷中、低終濃度組，黨參皂苷L-1低終濃度組，黨參成分SFE提取物低終濃度組有顯著療效，與模型組比較；②黨參皂苷L-1中終濃度組，黨參成分SFE提取物中終濃度組也有療效，但不如上述組，與模型組比較；③黨參總皂苷高終濃度組，黨參皂苷L-1高終濃度組無(wú)保護(hù)作用，與模型組比較;④并且黨參成分SFE提取物高終濃度組可能還會(huì)加重缺氧/缺糖對(duì)大鼠腦微血管