NE對離體腦微血管內(nèi)皮細胞缺血性損傷的作用.pdf

1、背景：缺血性腦血管疾病是人類死亡率最高的三大疾病之一，深入研究缺血性腦血管疾病的病理生理機制，尋找治療缺血性腦血管疾病的新靶點并開發(fā)相應(yīng)的治療藥物，不僅具有重要的社會效益，也有顯著的經(jīng)濟效益。目前，關(guān)于腦缺血/再灌注損傷的病理生理機制研究主要集中在能量代謝障礙、氧自由基應(yīng)激、細胞內(nèi)游離鈣超載、興奮性氨基酸釋放過多、線粒體的損傷以及神經(jīng)元細胞凋亡程序啟動等。近年來，炎癥反應(yīng)在腦缺血/再灌注中的作用逐漸引起人們的重視?，F(xiàn)已證實，中性粒細胞(

2、polymorphonuclear leukocyte，PMN)及炎癥細胞因子觸發(fā)的血管炎癥反應(yīng)在神經(jīng)元腦缺血/再灌注損傷中具有重要作用。中性粒細胞在腦缺血/再灌注損傷中的作用主要包括兩個方面：(1)機械性阻塞作用；(2)釋放炎癥介質(zhì)與蛋白水解酶(主要是彈性蛋白酶)，加重缺血腦組織損傷。 彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是機體內(nèi)一種具有強烈水解活性的蛋白水解酶，最適底物為彈性蛋白。研究表明，NE不僅參與

3、了多種炎癥性疾病如慢性支氣管炎、支氣管擴張癥、生殖道感染等疾病的發(fā)生發(fā)展，也在組織、器官的缺血/再灌注損傷中如急性肺損傷起著重國家自然科學基金資助項目(No.30572074)要作用，抑制NE活性對這些組織、器官的缺血/再灌注損傷有顯著的保護作用。研究同時發(fā)現(xiàn)，大腦微血管內(nèi)皮細胞受損是腦血管疾病的早期病變和基本誘因。所以，通過研究NE及其特異抑制劑西維來司鈉在缺氧復(fù)氧過程中對于大腦微血管內(nèi)皮細胞的影響，則可以進一步證實NE參與了腦缺血/

4、再灌注損傷，NE抑制劑西維來司鈉(Sivelestat sodium，Siv)可能對腦缺血/再灌注損傷有保護作用。 目的：(1)進一步探討大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法并對之進行形態(tài)學觀察。為建立離體血腦屏障提供基礎(chǔ)。(2)建立一種方便、穩(wěn)定、可靠的體外細胞氧糖剝奪(oxygenglucose deprivation，OGD)/復(fù)氧(reoxygenation)模型。(3)明確NE是否通過損傷腦微血管內(nèi)皮細胞等機制加重缺血/再灌

5、注后的腦損傷，因而NE將成為腦血管疾病治療一個新的作用靶點，NE抑制劑西維來司鈉也將成為一種新型的神經(jīng)保護劑用于腦血管疾病的治療，這無疑將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。 方法：原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞，通過倒置顯微鏡、免疫細胞化學、電鏡進一步鑒定，采用MTT法測定生長曲線，分離大鼠外周血中性粒細胞，建立體外氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖和中性粒細胞損傷模型。將實驗分5組：正常對照組(NC組)、缺血/再灌注模型組(I/R組)；模型+中性

6、粒細胞損傷組(I/R+PMN組)；模型+中性粒細胞損傷+西維來司鈉組(UR+PMN+Siv組)，其中，可按西維來司鈉的不同濃度分為低、中、高三個劑量亞組；模型+中性粒細胞損傷+依達拉奉組(I/R+PMN+Eda組)。采用ELISA定量測定每組中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的表達、MTT法和LDH測定每組細胞的存活率和損傷程度、放射免疫法測定每組細胞內(nèi)皮素-1(ET-1)的分泌量、細胞免疫化學定性檢測每組細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的

7、表達、RT-PCR半定量測定每組BMEC中血管生成素受體-2 mRNA(Tie-2 mRNA)的表達。 結(jié)果：(1)經(jīng)形態(tài)學、免疫細胞化學、電鏡鑒定所培養(yǎng)的細胞為大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞。(2)離體BMEC經(jīng)氧糖剝奪4h/復(fù)氧復(fù)糖24h后可模擬腦缺血/再灌注損傷。(3)測定NE、MTT、LDH、ET-1、ICAM-1、Tie-2 mRNA均顯示：氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖過程能對BMEC造成損傷，I/R組與NC組比較有明顯的統(tǒng)計學差異(p<

8、0.05)；中性粒細胞能加重對BMEC的損傷，I/R組與I/R+PMN組之間比較亦有統(tǒng)計學差異(p<0.05)；西維來司鈉處理后，血管內(nèi)皮細胞的損傷明顯減輕，I/R+PMN組與I/R+PMN+SIR組比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，并且NE測定以及MTT、LDH實驗提示在西維來司鈉三個劑量組之間存在明顯的量．效關(guān)系，其對BMEC的保護作用有劑量依賴性。 結(jié)論：(1)成功的培養(yǎng)出了大鼠微血管內(nèi)皮細胞，為建立離體血-腦屏障，研究腦