壓力、剪應(yīng)力與藥物對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的聯(lián)合作用.pdf

1、本研究課題以大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cerebralmicrovascularendothelialcell，rCMEC)為研究材料，采用細(xì)胞生物學(xué)方法、分子生物學(xué)與生物物理檢測(cè)方法相結(jié)合，包括細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境壓力和剪應(yīng)力的調(diào)控、三維立體培養(yǎng)方式觀察血管生成、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡、熒光定量PCR方法檢測(cè)VEGF的表達(dá)、原子力顯微鏡檢測(cè)粘性相關(guān)量和彈性相關(guān)量以及多元統(tǒng)計(jì)等方法，主要從以下幾個(gè)方面探討了生物力與藥物對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生

2、成的影響?！　”緦?shí)驗(yàn)利用我室自己研制的可單獨(dú)調(diào)節(jié)壓力和剪應(yīng)力的平板剪切裝置，采用多因素多水平試驗(yàn)的高效設(shè)計(jì)方法——正交設(shè)計(jì)(orthogonaldesign)，通過(guò)在37℃、5％CO2條件下，對(duì)rCMEC施加不同水平的壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪16h，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，觀察了壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪聯(lián)合作用對(duì)rCMEC細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，多元方差分析結(jié)果(表1-1)表明，壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪三因素以及它們之間的一級(jí)交互作用和二級(jí)交互作用均

3、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，進(jìn)一步經(jīng)一元方差分析表明，對(duì)細(xì)胞周期的各期及凋亡而言，各因素的二級(jí)交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，故各因素的主效應(yīng)及其一級(jí)交互作用不再考慮，而以三因素的聯(lián)合作用為主。通過(guò)正交設(shè)計(jì)的方差分析綜合來(lái)看，凋亡最少的綜合條件是壓力0mmHg、剪應(yīng)力10dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml。在該條件下，處于S期細(xì)胞也在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的中上水平。2.壓力、剪應(yīng)力與川芎嗪對(duì)rCMEC血管生成的影響本實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量設(shè)

4、計(jì)，利用Matrigel體外培養(yǎng)rCMEC的方法，對(duì)經(jīng)不同壓力、剪應(yīng)力及川芎嗪作用16h后的rCMEC在Matrigel上的血管生成進(jìn)行圖像分析，結(jié)果(表2-1)顯示對(duì)血管生成而言，兩種壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪組合(實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組)與對(duì)照之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且不同實(shí)驗(yàn)條件下不同時(shí)間血管生成的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明當(dāng)相對(duì)壓力0mmHg、剪應(yīng)力20dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml時(shí)，血管生成旺盛，在

5、實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)；而當(dāng)相對(duì)壓力40mmHg、剪應(yīng)力10dyn/cm2、川芎嗪126μg/ml時(shí)，血管生成緩慢，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)先增長(zhǎng)后緩慢下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示生物力和藥物聯(lián)合作用對(duì)血管生成的影響不容忽視。　　本實(shí)驗(yàn)利用前述實(shí)驗(yàn)裝置，采用成組設(shè)計(jì)，通過(guò)在37℃、5％CO2條件下，對(duì)rCMEC施加不同水平的壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪16h，經(jīng)相對(duì)熒光定量PCR方法測(cè)定，以VEGF為目的基因(±argetgene)，β-actin為內(nèi)對(duì)照基

6、因(internalcontrolgene)，同時(shí)以對(duì)照組為校準(zhǔn)(calibrator)，按Livak等的-△△CT方法來(lái)進(jìn)行計(jì)算，觀察了壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪聯(lián)合作用對(duì)rCMECVEGF表達(dá)的影響，結(jié)果(表3-1)經(jīng)方差分析表明，當(dāng)相對(duì)壓力0mmHg、剪應(yīng)力20dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml時(shí)，VEGF的表達(dá)是對(duì)照的4.44倍(P＜0.01)；而當(dāng)相對(duì)壓力40mmHg、剪應(yīng)力10dyn/cm2、川芎嗪126μg/ml時(shí)，VEGF的

7、表達(dá)卻僅是對(duì)照的0.16倍(P＜0.01)。這說(shuō)明壓力、剪應(yīng)力和川芎嗪三者不同的組合對(duì)VEGF表達(dá)的影響不同，可促進(jìn)或抑制VEGF的表達(dá)，從而干預(yù)血管生成?！　”緦?shí)驗(yàn)利用前述實(shí)驗(yàn)裝置，采用成組設(shè)計(jì)，通過(guò)在37℃條件下，對(duì)rCMEC施加不同水平的壓力、剪應(yīng)力和替莫唑胺8h，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，觀察了壓力、剪應(yīng)力和替莫唑胺聯(lián)合作用對(duì)rCMEC細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果(表4-1)經(jīng)方差分析表明，對(duì)凋亡的影響而言，兩種條件即相對(duì)壓力42m

8、mHg、剪應(yīng)力20dyn/cm2和替莫唑胺0μmol/L以及相對(duì)壓力0mmHg、剪應(yīng)力30dyn/cm2和替莫唑胺300μmol/L與對(duì)照比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而對(duì)細(xì)胞周期的各期而言，卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。可能是因?yàn)槲覀冊(cè)诩羟袑?shí)驗(yàn)時(shí)玻片上的細(xì)胞生長(zhǎng)24h已經(jīng)鋪滿，90％以上的細(xì)胞處于G0G1期，因而形成了類似細(xì)胞同步化的現(xiàn)象；或者是剪切導(dǎo)致的關(guān)卡效應(yīng)，使細(xì)胞周期停留在G1-S轉(zhuǎn)變期，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S和

9、G2/M期細(xì)胞比例下降，同時(shí)出現(xiàn)了凋亡亞二倍體峰，提示細(xì)胞凋亡的發(fā)生與剪切延緩細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換有關(guān)，但尚不能判斷凋亡細(xì)胞具體主要來(lái)源于細(xì)胞周期的何期，仍需進(jìn)一步研究?！　”緦?shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)，利用Matrigel體外培養(yǎng)rCMEC的方法，對(duì)經(jīng)不同壓力、剪應(yīng)力及替莫唑胺作用8h后的rCMEC在Matrigel上的血管生成進(jìn)行測(cè)量，3因素8水平共進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(表5-1)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得到多元回歸方程如下：y=2332978.20-4346.

10、21X3+403.38X1X2-717.32X2X2+83.86X2X3經(jīng)方差分析證明方程有意義，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也表明方程的擬合程度亦較好。從方程可知：對(duì)于降低血管生成而言，替莫唑胺與剪應(yīng)力作用為主。對(duì)于促進(jìn)血管生成而言，壓力與剪應(yīng)力有聯(lián)合作用，剪應(yīng)力與替莫唑胺的聯(lián)合作用則較小。促進(jìn)血管生成的優(yōu)化組合是相對(duì)壓力42mmHg、剪應(yīng)力11.8dyn/cm2和替莫唑胺0μmol/L，血管生成最大為2433012.84μm2；抑制血管生成的優(yōu)化組合是

11、相對(duì)壓力0mmHg、剪應(yīng)力42dyn/cm2和替莫唑胺350μmol/L，血管生成最小為779210.38μm2?！　”緦?shí)驗(yàn)利用前述實(shí)驗(yàn)裝置，采用成組設(shè)計(jì)，通過(guò)在37℃條件下，對(duì)rCMEC施加不同水平的壓力、剪應(yīng)力和替莫唑胺8h，經(jīng)相對(duì)熒光定量PCR方法測(cè)定，按Livak等的-△△CT方法來(lái)進(jìn)行計(jì)算，觀察了壓力、剪應(yīng)力和替莫唑胺聯(lián)合作用對(duì)rCMECVEGF表達(dá)的影響，結(jié)果(表6-1)經(jīng)方差分析表明，當(dāng)相對(duì)壓力42mmHg、剪應(yīng)力20d

12、yn/cm2、替莫唑胺0μmol/L時(shí)，VEGF的表達(dá)是對(duì)照的6.01倍(P＜0.01)；而當(dāng)相對(duì)壓力0mmHg、剪應(yīng)力30dyn/cm2、替莫唑胺300μmol/L時(shí)，VEGF的表達(dá)卻僅是對(duì)照的0.11倍(P＜0.01)。說(shuō)明壓力、剪應(yīng)力和替莫唑胺三者不同的組合對(duì)VEGF表達(dá)的影響不同，或促進(jìn)或抑制VEGF的表達(dá)。同時(shí)我們還觀察了壓力、剪應(yīng)力和替莫唑胺聯(lián)合作用對(duì)rCMEC粘彈性的影響，通過(guò)使用生物型原子力顯微鏡對(duì)rCMEC成像后，選擇

13、細(xì)胞膜的不同部位，實(shí)施力曲線至飽和，從記錄的AmplitudevsDistance曲線上計(jì)算粘性相關(guān)量和彈性相關(guān)量，結(jié)果(表6-2)顯示兩實(shí)驗(yàn)組K值均比對(duì)照組明顯增大(P＜0.01)，且兩種處理之間的差別亦顯著(P＜0.01)；但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的△S值變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示經(jīng)相對(duì)壓力42mmHg、剪應(yīng)力20dyn/cm2、替莫唑胺0μmol/L處理8h和經(jīng)相對(duì)壓力0mmHg、剪應(yīng)力30dyn/cm2、替莫唑胺300μmo