微血管內(nèi)皮細胞對造血干細胞增殖的研究.pdf

1、目的：研究微血管內(nèi)皮細胞（MEC）對造血干細胞（HSC）增殖的影響，尋找促進HSC增殖的方法。
　　方法：
　　1. MEC分離、培養(yǎng)及鑒定：將肺組織經(jīng)I型膠原酶消化獲得的細胞，在20％FBS、2ng/mlVEGF、肝素100u/ml、DMEM-F12中培養(yǎng)，24h全換液，此后每2-3天全量換液，鏡下觀察細胞形態(tài)變化及生長情況，取第8天細胞進行FITC-CD31免疫熒光鑒定，“鋪路石”細胞用于流式鑒定、傳代培養(yǎng)和共培養(yǎng)。連續(xù)

2、8天觀察P1代MEC生長情況、形態(tài)變化，并逐日細胞計數(shù)，繪制P1代MEC生長曲線。
　　2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定：密度梯度離心法獲得小鼠骨髓單個核細胞(MNC)，MACS-CD117+磁珠分選HSC。應(yīng)用流式細胞計數(shù)儀（FACS）檢測陽性細胞的純度及HSC CD117CD34共表達率。
　　3.微血管內(nèi)皮細胞對造血干細胞增殖的研究：設(shè)立對照組（HSC）、共培養(yǎng)組（MEC+HSC），體外培養(yǎng)7天，觀察HSC生長情況、細

3、胞計數(shù)、繪制生長曲線、計算HSC擴增倍數(shù)。收集共培養(yǎng)組HSC，F(xiàn)ACS檢測共培養(yǎng)組HSC CD117CD34共表達率，與共培養(yǎng)前對比。
　　結(jié)果：
　　1.MEC分離、培養(yǎng)及鑒定：原代細胞：6h貼壁，24h少數(shù)細胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)細胞呈圓形。48h見多角形、短梭形細胞。第3d細胞聚集生長，形成形態(tài)大小較一致的細胞團。第6d相鄰細胞偽足彼此相連，第10d細胞繼續(xù)增多，第14d細胞生長達80%融合，呈“鋪路石”外觀。?傳代細胞：

4、4h貼壁，P1代MEC第3d見多角形、短梭形細胞。第4d細胞聚集生長，形成形態(tài)大小較一致的細胞團，第7d細胞密集生長，多數(shù)呈梭形、不規(guī)則形。第8d細胞生長近80%融合。P1代MEC生長曲線：第4到7天為對數(shù)生長期，隨后進入平臺期。CD31抗體免疫熒光檢測陽性率為54.5%。MEC FACS鑒定vWF、CD31、CD34、CD45表達率分別為：81.39%、45.8%、57.48%、0.17%。
　　2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定

5、：本實驗中平均每只GFP小鼠骨髓經(jīng)密度梯度離心后可以獲得約1.1×108個MNC，活細胞率為98%。MNC經(jīng)MACS CD117磁珠分選后可以獲得約4.7×105個 CD117+細胞，活率為97%。骨髓MNC中CD117+細胞含量約0.43%。磁珠分選后的CD117+HSC純度為99.51%，HSC CD117CD34共表達率為75.28%。熒光顯微鏡下：HSC呈綠色，圓形，大小均一。
　　3.微血管內(nèi)皮細胞對造血干細胞增殖的研究

6、：培養(yǎng)時間增加，兩組HSC數(shù)均增加，共培養(yǎng)組較對照組更明顯。共培養(yǎng)組與對照組細胞數(shù)的比值：第1d，共培養(yǎng)組細胞數(shù)約為對照組的1.21倍（P<0.01），第2d，共培養(yǎng)組約為對照組的1.35倍（P<0.05），第3d，共培養(yǎng)組約為對照組的1.50倍（P<0.01），第4d，共培養(yǎng)組約為對照組的1.72倍（P<0.01），第5d，共培養(yǎng)組約為對照組的1.71倍（P<0.01），第6d，共培養(yǎng)組約為對照組的1.75倍（P<0.01），第7d，

7、共培養(yǎng)組約為對照組的1.78倍（P<0.01）。共培養(yǎng)組與對照組細胞數(shù)比值變化曲線示：比值逐漸增加，第4d變化最明顯。D1-D7較D0的HSC數(shù)比較：第7d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約12.31倍（P<0.01），對照組擴增約6.92倍（P<0.01）；第6d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約11.28倍（P<0.01），對照組擴增約6.45倍（P<0.01）；第5d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約9.72倍（P<0.01），對照組擴增約5.66

8、倍（P<0.01）；第4d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約7.31倍（P<0.01），對照組擴增約4.25倍（P<0.01）；第3d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約3.45倍（P<0.01），對照組擴增約2.30倍（P<0.01）；第2d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約1.92倍（P<0.01），對照組擴增約1.42倍（P<0.01）；第1d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴增約1.20倍（P<0.01），對照組擴增約0.99倍（P>0.05）。共培養(yǎng)7天后