小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最小的一種膠質(zhì)細(xì)胞,它起源于胚胎期的骨髓單核細(xì)胞,在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育胚胎期或新生期進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),為圓形或梭形的阿米巴樣小膠質(zhì)細(xì)胞,主要分布于大腦皮層、胼胝體、皮層下白質(zhì)、內(nèi)被蓋、穹隆、小腦白質(zhì)、視網(wǎng)膜等區(qū)域。正常情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息或休眠狀態(tài),且數(shù)量較少,當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血、缺氧或受到損傷時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞,迅速被激活并發(fā)揮“雙刃”作用。目前研

2、究表明顯示,一方面,小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞毒素、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子,加重腦組織的損傷;另一方面,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞又通過(guò)分泌細(xì)胞因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)。一直以來(lái),小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著重要的免疫細(xì)胞作用,分泌炎癥因子引發(fā)炎癥反應(yīng),在大腦中發(fā)揮著重要的作用,但是其對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及機(jī)制還不清楚。
　　 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、基膜及周細(xì)胞等共同組成了的高度特化的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)單元.血腦屏障

3、(blood-brain barrier,BBB)。其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接和粘附連接是構(gòu)成血腦屏障結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),也是維持血腦屏障功能的關(guān)鍵。最近研究顯示大腦血流的降低負(fù)性調(diào)節(jié)了記憶和學(xué)習(xí)中必需蛋白質(zhì)的合成,并且也許最終導(dǎo)致了神經(jīng)炎癥的發(fā)生和神經(jīng)元的死亡。
　　 我實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管的生成?；诖?通過(guò)檢測(cè)血管生成相關(guān)基因mRNA的改變和蛋白質(zhì)的改變,進(jìn)一步檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

4、細(xì)胞遷移和增殖的改變,同時(shí)利用siRNA干擾的方法干擾小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成有所改變的基因,進(jìn)一步研究其對(duì)血管生成的影響,期望從腦微血管的角度去分析AD的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、體外血管形成試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)HBMEC形成血管的能力是否有影響。
　　 2、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)HBMEC細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 3、WST試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)HBMEC細(xì)胞增殖能

5、力的影響。
　　 4、ELISA試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清中TNF-a的分泌的情況。
　　 5、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)TNF-a對(duì)HBMEC細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 6、WST試驗(yàn)檢測(cè)TNF-a對(duì)HBMEC細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 7、體外血管形成試驗(yàn)檢測(cè)TNF-a對(duì)HBMEC形成血管能力的影響。
　　 8、Real-time PCR試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)HBMEC形成血管生成相關(guān)基因mRNA水平上的改變

6、。
　　 9、Western blot試驗(yàn)體外血管檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)HBMEC形成血管生成相關(guān)基因蛋白質(zhì)水平上的改變。
　　 10、PCR方法對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的血管生成相關(guān)基因的亞型進(jìn)行分析,并克隆其全長(zhǎng)至真核細(xì)胞表達(dá)載體。
　　 11、siRNA干擾試驗(yàn)干擾小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成有所改變的基因,并用Western blot試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。
　　 12、體外血管形成試驗(yàn)檢測(cè)干擾后的H

7、BMEC其小膠質(zhì)細(xì)胞上清促進(jìn)血管腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的能力是否有改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、體外血管形成試驗(yàn)結(jié)果顯示,小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的上清能夠促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管的生成。
　　 2、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的上清組與10%FBSHG-DMEM對(duì)照組相比,HBMEC細(xì)胞的遷移能力上升。
　　 3、WST試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的上清組與10%FBSHG-DMEM對(duì)照組相比,HBMEC細(xì)胞的增殖

8、能力下降。
　　 4、ELISA試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上清中存在較高濃度的TNF-alpha。
　　 5、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)TNF-a能夠促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
　　 6、WST試驗(yàn)檢測(cè)TNF-a對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。
　　 7、體外血管形成試驗(yàn)結(jié)果顯示,TNF-alpha能夠促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。
　　 8、Real-time PCR試驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的上清組對(duì)HBM

9、EC形成血管生成相關(guān)基因ephrinA3、ephrinA4、KDR在mRNA水平上與10%FBSHG-DMEM對(duì)照組相比表達(dá)水平增高。
　　 9、Western blot結(jié)果顯示,小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的上清組對(duì)HBMEC形成血管生成相關(guān)基因ephrinA3、ephrinA4、KDR在蛋白質(zhì)水平上與10%FBSHG-DMEM對(duì)照組相比表達(dá)水平增高。
　　 10、PCR結(jié)果顯示,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的血管生成相關(guān)基因ephri

10、nA4的亞型1和亞型2在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),并成功克隆獲得ephrinA3、ephrinA4亞型1全長(zhǎng)基因序列,并連接到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisB。
　　 11、siRNA干擾試驗(yàn)成功干擾小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成有所改變的基因ephrinA3、ephrinA4,并用Western blot試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。
　　 12、體外血管形成試驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾后的HBMEC其小膠質(zhì)細(xì)胞上清促進(jìn)腦