腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、研究背景和目的:神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的一類細(xì)胞。它具有以下特性：(1)體外在絲裂原信號刺激下可大量增殖；(2)在體外去除絲裂原信號后即分化為神經(jīng)系終末細(xì)胞，因而失去增殖潛能而不具有致瘤性；(3)能與宿主細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)整合，有利于功能重建。神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究是目前研究的熱點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞群體的增殖

2、、分化和存活依賴一些信號分子的相互協(xié)調(diào)作用，這些信號分子包括白介素、FGF-2、EGF、TGF、LIF、BDNF、GDNF等，但是目前的研究顯示，即使使用最好的神經(jīng)營養(yǎng)因子，最多只能使一半以內(nèi)的干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。這可能是由于NSCs增殖、向不同終末神經(jīng)細(xì)胞方向分化需要特定的局部微環(huán)境的支持。這種微環(huán)境包括NSCs以外的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)、微血管成分及其相關(guān)的一系列信號分子。微環(huán)境各因素的整體化、系統(tǒng)化相互協(xié)調(diào)和配合，在時間和空間順序上調(diào)

3、控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。 新近研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有重要的屏障保護(hù)和半透膜的營養(yǎng)輸送作用，同時還具有極其重要的代謝控制和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞能合成和釋放幾十種生物活性物質(zhì)，這些信號分子在組織、細(xì)胞的生長、發(fā)育中起到極為重要的作用，如研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)及其受體FLK-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、堿性成纖維生長因子(BFGF)等活性分子，激活一些分化轉(zhuǎn)錄因子如Neur

4、oD和Pax6、Pdx1，最終指導(dǎo)胚胎組織的細(xì)胞遷移、分化和生長，使得胚胎組織逐步成為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的成熟器官。 研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞的增殖和分化是由包括微血管在內(nèi)的局部微環(huán)境調(diào)控的，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程中，腦室壁周圍細(xì)胞能產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子刺激局部血管的生長，在成熟的腦組織的海馬、室管膜下區(qū)等富含神經(jīng)干細(xì)胞的區(qū)域，神經(jīng)干細(xì)胞分布與微血管的位置關(guān)系極為密切。這些研究提示，無論是發(fā)育中或是成熟的中樞神經(jīng)，神經(jīng)干細(xì)胞與腦微血管內(nèi)

5、皮細(xì)胞(Brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)存在著密切關(guān)系。目前，BMECs是否能夠調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化，迄今為止，國內(nèi)尚未見有相關(guān)研究的報道，國外報道也極為罕見?；诖?，本課題擬自新生大鼠腦組織分別分離、培養(yǎng)NSCs和BMECs，然后，建立起兩者的共培養(yǎng)模型，探討腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響，為NSCs應(yīng)用于腦損傷修復(fù)與再生的研究奠定基礎(chǔ)。 方法:1.NSCs

6、的分離培養(yǎng)和鑒定從新生大鼠分離海馬組織和室管膜下區(qū)(subventricularzone，SVZ)的神經(jīng)干細(xì)胞，并建立NSCs的體外培養(yǎng)體系，觀察NSCs的生長特性，免疫熒光法檢測NSCs的標(biāo)志物神經(jīng)巢蛋白(Neuroepithelialstemcellprotein，nestin)；誘導(dǎo)分化后，檢測神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)志物神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament，NF)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glialfibrillaryac

7、idicprotein，GFAP)。 2.BMECs的分離培養(yǎng)和鑒定從新生大鼠大腦皮層，通過二次酶消化和二次梯度離心方法分離腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察BMECs的生長特性，以Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行免疫組化檢測。 3.BMECs對NSCs與增殖和分化的影響實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組：含1％FBS(胎牛血清)和2％B27的DMEM/F12培養(yǎng)NSCs；共培養(yǎng)組：利用transwell建立神經(jīng)干細(xì)胞與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型，加入對照組培

8、養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；ECGF組：在對照組培養(yǎng)液加入ECGF(endothelialcellgrowthfactor，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)培養(yǎng)細(xì)胞。 在第7天通過相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察各組細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行nestin和NF免疫熒光染色并計算各陽性細(xì)胞比例；然后共培養(yǎng)組去除BMECs和ECGF組去除ECGF，各組均改用含1％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)，通過相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察各組細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行NF免疫熒光染色計數(shù)，計算各組陽性細(xì)胞率。各組

9、結(jié)果分別進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q法進(jìn)行組間兩兩比較的顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。 結(jié)果:1.第一部分：分離的細(xì)胞呈細(xì)胞克隆球懸浮態(tài)生長，免疫熒光檢測nestin陽性，誘導(dǎo)分化后，NF和GFAP均陽性，證實(shí)分離的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2.第二部分：分離的細(xì)胞呈典型的鵝卵石形，區(qū)域性單層生長，“旋渦狀”分布，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測陽性，證實(shí)分離的細(xì)胞為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

10、 3.第三部分：成功建立了NSCs和BMECs的共培養(yǎng)模型。在實(shí)驗(yàn)第7天發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的NSCs保持nestin陽性的比例最高，平均為66.64％，而ECGF組次之，對照空白組最少，僅34.94％，各組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。共培養(yǎng)組NF陽性細(xì)胞率較空白組和ECGF組的均少，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)，但與ECGF組未見有顯著性差異(P＞0.05)；而ECGF組NF陽性細(xì)胞率與空白組比較也有顯著性差異(P＜

11、0.05)。當(dāng)共培養(yǎng)組在去除BMECs和ECGF組去除ECGF后第4天，共培養(yǎng)組的NSCs分化成神經(jīng)元的比例最高，平均為55.84％，而ECGF組次之，對照空白組最少，僅30.06％，各組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。 結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)自新生大鼠腦組織內(nèi)成功分離并在體外培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且成功建立了BMECs和NSCs的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。 2.BMECs能促進(jìn)NSCs的增殖，抑制其分化，經(jīng)BME