低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景和目的：
　　近年來(lái)磁場(chǎng)的作用逐漸受到人們的重視，它是一種安全有效的物理治療手段，在治療骨關(guān)節(jié)等疾病方面已經(jīng)取得了良好的療效，早有報(bào)道證明體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成可以被脈沖磁場(chǎng)有效地促進(jìn)，F(xiàn)GF-2的分泌也同樣可以被磁場(chǎng)所促進(jìn)，因此人們不斷尋找一種利用磁場(chǎng)這種無(wú)創(chuàng)療法改善心血管疾病的途徑。近年來(lái)缺血性心臟病的發(fā)病率逐年上升，而治療缺血性心臟病的主要手段就是促進(jìn)內(nèi)皮的再生，進(jìn)一步使新的血管形成

2、。微血管內(nèi)皮細(xì)胞在功能上有許多與內(nèi)皮細(xì)胞相似的地方，它可以參與血管的再生，是心臟的一個(gè)重要組成部分，對(duì)改善心血管疾病起到重要的作用。但是現(xiàn)在對(duì)于這方面的研究很少，我們只能在探索中前進(jìn)，尋找磁場(chǎng)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的最佳波形，強(qiáng)度以及時(shí)間，使磁場(chǎng)在治療心血管疾病上邁出一大步,為其在臨床的早日應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：不同波形低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　1.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，利用

3、胰酶以及膠原酶消化法培養(yǎng)，用差速貼壁原理純化細(xì)胞。
　　2.實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)大組：矩形波組以及三角波形磁場(chǎng)組，每大組又分為對(duì)照組和處理組，每個(gè)處理組內(nèi)各分為0.6mT、1.2mT、1.8mT和2.4mT四個(gè)磁場(chǎng)強(qiáng)度照射組。對(duì)照組不接受磁場(chǎng)輻照，其他條件輻照組均與磁場(chǎng)輻照組相一致。各磁場(chǎng)輻照組的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞均于第一次傳代在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞貼壁時(shí)開(kāi)始接受磁場(chǎng)輻照，選用脈沖磁場(chǎng)頻率為15Hz，輻照時(shí)間為4h/d，連

4、續(xù)照射5d。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞各周期的變化，Hoechst33258染色鑒定細(xì)胞凋亡狀況，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架染色，硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的變化。
　　實(shí)驗(yàn)二：三角波形低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期的影響
　　1.胰酶和膠原酶消化法培養(yǎng)原代的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，差速貼壁法純化細(xì)胞。
　　2.取心肌

5、微血管內(nèi)皮2代細(xì)胞，將其分為4個(gè)組：即對(duì)照組、1.0mT組、1.4mT組和1.8mT組。對(duì)照組的細(xì)胞不曝磁，其他條件均與1.0mT、1.4mT及1.8mT組一致。1.0mT、1.4mT及1.8mT組的CMECs均于傳代后，鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始貼壁時(shí)，接受曝磁，以頻率為15Hz的脈沖磁場(chǎng)刺激4h/d，連續(xù)照射3d。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞各周期的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

6、>　　實(shí)驗(yàn)一：不同波形低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　1.成功培養(yǎng)出原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞并成功純化。
　　2.矩形波作用后經(jīng)CCK-8檢測(cè)顯示4個(gè)磁場(chǎng)強(qiáng)度作用后與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖水平均有提高，其中以1.8mT組增殖最為明顯（0.9679±0.057vs0.7552±0.0334；P＜0.01）。三角形波干預(yù)后0.6mT組與1.8mT組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1.2mT組與2.4mT組

7、與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.矩形波輻照CMECs的遷移加快，各組遷移的細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）與對(duì)照組比較均有顯著增多，其中以1.8mT組磁場(chǎng)強(qiáng)度作用最為明顯（48.00±4.18vs23.80±3.11，P＜0.01）。三角波0.6mT組和1.8mT組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1.2mT組與2.4mT組與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯增多（P＞0.05）。
　　4.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞經(jīng)矩形

8、波輻照后，各組與對(duì)照組比較細(xì)胞各周期（G1期，S期以及G2期）均有明顯變化，（G2+S）期的細(xì)胞明顯增多，（P＜0.01），其中以1.8mT組變化最為顯著。經(jīng)三角波輻照后1.8mT組和0.6mT組對(duì)周期均有一定的影響（P＜0.05），1.2mT組和2.4mT組與對(duì)照組相比細(xì)胞周期幾乎沒(méi)有變化（P＞0.05）。
　　5.在熒光顯微鏡下觀察，矩形波輻照后各組凋亡率均有減低（P＜0.05）。三角波輻照后0.6mT組和1.8mT組凋亡率同

9、樣減低（P＜0.05），1.2mT組和2.4mT組凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（2.18±0.19vs2.30±0.35；2.24±0.27vs2.30±0.35；P＞0.05）。
　　6.經(jīng)矩形波輻照后細(xì)胞與對(duì)照組比較細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了重組，鏡下觀察見(jiàn)綠色熒光示經(jīng)FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色的細(xì)胞骨架，紅色熒光為經(jīng)碘化吡啶（PI）染色的細(xì)胞核，經(jīng)矩形波磁場(chǎng)輻照后各組的熒光染色強(qiáng)度均增加，細(xì)胞膜下的應(yīng)力纖維增多，聚集形成了綠色束樣結(jié)

10、構(gòu)，肌動(dòng)蛋白清晰可見(jiàn)，其中0.6mT組以及1.8mT組變化最為顯著，三角波輻照后0.6mT和1.8mT亦有相同表現(xiàn)。
　　7.經(jīng)矩形波輻照5d后，NO分泌能力測(cè)定顯示，與對(duì)照組相比，各組NO分泌能力均有明顯提高（P＜0.01）。經(jīng)三角波輻照后，0.6mT組與1.8mT組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1.2mT組與2.4mT組與對(duì)照組相比NO分泌能力未見(jiàn)明顯提高（P＞0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二：三角波形低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)

11、大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期的影響
　　1.用MTT比色法測(cè)定表明，1.4mT組和1.8mT組CMECs的增殖能力與對(duì)照組相比有顯著提高（P＜0.05）；而1.0mT組經(jīng)磁場(chǎng)輻照后，細(xì)胞增殖與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后，顯微鏡(×200)下觀察計(jì)數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可見(jiàn)，磁場(chǎng)能夠促進(jìn)CMECs遷移。1.4mT組和1.8mT組遷移

12、的細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05），1.0mT組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)3d曝磁后，1.4mT組和1.8mT組與對(duì)照組比較細(xì)胞各周期（G1期、S期和G2期）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞處于增殖分化期的數(shù)量明顯增多，其中1.8mT的組變化最為顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　在固定頻率下，大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移