低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內皮細胞、心肌細胞和骨髓源內皮祖細胞的影響.pdf

1、實驗背景和目的
　　脈沖磁場作為非侵入性物理療法治療骨折延遲愈合在臨床上已經取得了良好的效果，研究還表明脈沖磁場能夠明顯促進人臍靜脈內皮細胞和牛主動脈內皮細胞的體外血管化。脈沖磁場發(fā)揮生物學作用有“窗口”效應，不同頻率、時間和強度對細胞產生不同影響，尚無統(tǒng)一的參數(shù)標準。心肌微血管內皮細胞（CMECs）和心肌細胞（CMs）是心臟的主要組成成分，二者的功能受損與心臟病的發(fā)生發(fā)展密切相關，而內皮細胞的原始細胞即內皮祖細胞（EPCs）在治

2、療性血管新生，心臟和血管組織工程中有巨大的應用潛力。目前，有關脈沖磁場對上述3種細胞作用的研究尚少。本實驗旨在研究固定頻率和作用時間時，不同強度的低頻脈沖磁場（LF-PMFs）對體外培養(yǎng)大鼠CMECs的增殖、凋亡、超微結構、遷移和成血管能力的影響；對乳鼠CMs的活力和凋亡的影響以及對二者共培養(yǎng)條件下CMECs增殖和成血管能力的影響；對體外培養(yǎng)大鼠骨髓源EPCs的增殖、細胞周期、凋亡、遷移和成血管能力的影響，以尋找該條件下磁場發(fā)揮作用的適

3、宜強度，從而為LF-PMFs的深入研究和在臨床及心臟組織工程等領域的擴展應用提供實驗依據(jù)。
　　試驗方法
　　第一部分：LF-PMFs對大鼠CMECs，CMs和CMEC-CM共培養(yǎng)的影響
　　1.酶消化法結合差速貼壁法體外培養(yǎng)大鼠CMECs和CMs，電鏡鑒定內皮細胞表型；
　　2.CMECs和CMs完全隨機分為四組：對照組，1.0mT,1.4mT和1.8mT。除對照組外其余各組用頻率為15Hz不同強度的的方波脈沖

4、磁場刺激細胞，2h/d，持續(xù)刺激5d。對照組和曝磁后CMECs組：細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線，MTT法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，透射電鏡觀察超微結構，劃痕試驗和Transwell小室法檢測遷移能力，鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架變化，管狀結構形成試驗和三維（3D）立體培養(yǎng)檢測細胞成血管能力；對照組和曝磁后CMs組：MTT法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測凋亡；
　　3.CMEC-CM共培養(yǎng)：MTT法檢測共培養(yǎng)和非共培養(yǎng)

5、CMECs磁場內外增殖情況；
　　4.CMEC-CM共培養(yǎng)3D管樣結構形成試驗和HE染色：試驗分4組：CMs單獨3D培養(yǎng)，CMECs單獨3D培養(yǎng)，CMEC-CM3D共培養(yǎng)，1.4mT刺激下CMEC-CM3D共培養(yǎng)。
　　第二部分：LF-PMFs對大鼠骨髓源EPCs的影響
　　1.密度梯度離心法獲得大鼠骨髓源EPCs，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色鑒定EPCs表型；
　　2.EPCs完全隨機分為四

6、組：對照組，1.0mT,1.4mT和1.8mT。除對照組外其余各組用頻率為15Hz不同強度的的方波脈沖磁場刺激細胞，2h/d，持續(xù)刺激5d。對照組和曝磁后EPCs組：MTT法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，劃痕試驗檢測細胞遷移能力，管狀結構形成試驗和3D培養(yǎng)檢測細胞成血管能力。
　　實驗結果
　　1.體外成功培養(yǎng)出含內皮細胞特有的超微結構Weible-Palade(WP)小體的CMECs。
　　2.CM

7、ECs經1.4mT磁場干預后加速增殖，生長曲線峰值提前并提高，DNA合成活躍〔S期與對照組比較：(13.10±0.15)％vs(3.90±0.18)％，P＜0.01〕，凋亡無明顯改變，超微結構出現(xiàn)線粒體數(shù)量增多，內質網發(fā)達等細胞活性增強表現(xiàn)，細胞遷移能力顯著增強，細胞遷移面積百分比達86.1％，細胞骨架結構發(fā)生重組，肌動蛋白染色清晰，應力纖維增多，并集中在細胞膜下，管樣結構形成能力增強，3D培養(yǎng)時血管樣結構密度增加，分枝增長。
　

8、　3.CMs經1.4mT和1.8mT磁場干預后細胞活力顯著高于對照組（0.229±0.021vs0.196±0.012，0.252±0.012vs0.196±0.012，P＜0.05）,凋亡無明顯改變。
　　4.共培養(yǎng)時CMs能夠促進CMECs增殖，1.4mTLF-PMF對共培養(yǎng)和非共培養(yǎng)的CMECs同樣起著促進增殖作用。在3D培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)二者共培養(yǎng)時管樣結構較各自單獨培養(yǎng)時數(shù)量增多，密度增大，血管樣結構的長度也明顯增加，1.4

9、mT磁場干預后更為顯著。
　　5.體外成功培養(yǎng)出EPCs，并經Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色鑒定證實。
　　6.1.0mT和1.4mT磁場促進EPCs增殖，細胞周期分布發(fā)生改變，DNA合成期和合成后期細胞比例增加，1.8mT磁場也能促進EPCs增殖，但對細胞周期分布影響不明顯。流式凋亡檢測發(fā)現(xiàn)磁場特別是1.0mT和1.4mT磁場刺激能誘導EPCs凋亡。體外培養(yǎng)EPCs遷移能力差，各強度磁場對其遷移能力也無明

10、顯影響。不同強度磁場均能夠提高EPCs成血管能力，其中1.0mT和1.4mT作用明顯，1.8mT磁場作用相對弱。
　　結論
　　脈沖磁場發(fā)揮生物學作用的“窗口”效應明顯，不同強度磁場對體外培養(yǎng)細胞發(fā)揮作用不同。
　　15Hz的低強度方波脈沖磁場（特別是1.4mT）對體外培養(yǎng)的CMECs發(fā)揮促增殖，遷移，提高細胞活性和成血管能力的積極生物學效應，同時提高CMs的活力，在CMECs和CMs共培養(yǎng)時同樣發(fā)揮促CMECs增殖和