機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞滾動(dòng)粘附及分化的影響.pdf

1、當(dāng)血管損傷時(shí)，循環(huán)血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs）滾動(dòng)粘附到損傷部位會(huì)與破損內(nèi)膜層的內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）和暴露的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）接觸，受到ECs、VSMCs和血液動(dòng)力學(xué)的影響，進(jìn)而分化為ECs或VSMCs參與損傷血管的修復(fù)。EPCs需要經(jīng)過多重步驟：動(dòng)員，歸巢，捕獲，募集，滾動(dòng)

2、，粘附，遷移，分化等才能修復(fù)損傷內(nèi)膜層。因此，研究EPCs的粘附和分化行為，應(yīng)該考慮血流力學(xué)因素及鄰近細(xì)胞ECs和VSMCs的影響，并具有重要意義。
　　本文采用密度梯度離心法和差異貼壁法從人臍血中獲得EPCs，并以DiL-acLDL和UEA-lectin雙色熒光法鑒定。用人臍靜脈酶消化法和組織貼塊法分別原代培養(yǎng) ECs和VSMCs。
　　應(yīng)用玻璃管平行流動(dòng)腔觀測(cè)系統(tǒng)，其底部種植ECs，對(duì)EPCs施加0.1~0.4 dyn/

3、cm2范圍的切應(yīng)力，記錄切應(yīng)力大小和ECs對(duì)EPCs滾動(dòng)粘附速度的影響。再用TNFα（10 ng/ml）刺激處理 ECs，6 h, Western Blot方法檢測(cè)內(nèi)皮粘附分子VCAM, ICAM, P-Selectin和E-Selectin的表達(dá)以及它們對(duì)EPCs滾動(dòng)粘附速度的影響。
　　采用改進(jìn)的細(xì)胞張應(yīng)變加載系統(tǒng)，研究在5％-1.25 Hz牽拉ECs或 VSMCs條件下對(duì)與它們隔開培養(yǎng)的EPCs分化的影響。采用熒光定量PCR

4、技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD31、KDR、vWF和Calponin、α-actin、SM22α的RNA水平。Western blotting檢測(cè) ECs標(biāo)志蛋白VCAM，VSMCs標(biāo)志蛋白 Calponin、α-actin、SM22α的表達(dá)變化，同時(shí)也檢測(cè) p-Akt、p-ERK和p-Sirt1信號(hào)蛋白分子的表達(dá)變化。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①切應(yīng)力可以增加被捕獲EPCs的滾動(dòng)速度，且具有正相關(guān)性；② ECs可以降低被捕獲EPCs的滾動(dòng)速度，

5、TNFα處理 ECs后可以顯著增加 ECs粘附分子 VCAM、ICAM、P-Selectin和E-Selectin的表達(dá)，使EPCs的滾動(dòng)速度降低；③ ECs可以上調(diào)EPCs表達(dá)ECs標(biāo)志蛋白VCAM，上調(diào)幅度為63.39%，同時(shí)下調(diào)VSMCs標(biāo)志蛋白α-actin和Calponin的表達(dá)，下降幅度分別為26.6%和42.1%；④ VSMCs可以降低EPCs中ECs標(biāo)志分子CD31、KDR和vWF的RNA分子水平，同時(shí)增加VSMCs標(biāo)志

6、分子Calponin和SM22α的RNA水平；⑤牽拉ECs可以降低EPCs中ECs標(biāo)志分子CD31和vWF的RNA分子水平，增加VSMCs標(biāo)志分子SM22α和Calponin的RNA含量；⑥牽拉VSMCs與否對(duì)EPCs表達(dá)的VCAM和α-actin沒有顯著性差異，CD31、vWF和SM22α、Calponin的RNA水平也沒有明顯變化；⑦ ECs可以促進(jìn) EPCs中信號(hào)蛋白分子p-Akt、p-ERK和p-Sirt1的表達(dá)，牽拉ECs則抑

7、制p-Akt、p-ERK和p-Sirt1的表達(dá)；⑧ VSMCs對(duì)EPCs中信號(hào)蛋白分子p-Akt、p-ERK和p-Sirt1的表達(dá)沒有穩(wěn)定影響，牽拉VSMCs可以降低EPCs中p-Akt和p-ERK的表達(dá)，但不影響p-Sirt1表達(dá)。
　　上述結(jié)果表明，ECs可能通過粘附分子與EPCs相互粘附，從而降低EPCs的滾動(dòng)速度，TNFα可以增加這種粘附作用，從而更降低EPCs滾動(dòng)速度；ECs能夠促進(jìn)EPCs向ECs分化，牽拉ECs則促進(jìn)