紫杉醇水蛭素復(fù)合物對(duì)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percataneous coronary interventions，PCI）已經(jīng)成為狹窄性冠狀動(dòng)脈疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，藥物洗脫支架（drug-eluting stent，DES）（包括紫杉醇和雷帕霉素）以其顯著的抗再狹窄作用而被廣泛地應(yīng)用于冠心病的介入治療，即使對(duì)于急性心肌梗死，DES 仍可安全使用，并且可以降低支架內(nèi)再狹窄和再血管化的發(fā)生率。然而，置入DES 仍有10％-20％的再

2、狹窄率，部分DES 甚至并未降低心血管主要不良事件（major adversecardiac events，MACE）的發(fā)生率，延遲的支架血栓形成更是人們十分關(guān)注的焦點(diǎn)。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖和遷移引起的內(nèi)膜過(guò)度增生是導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄的關(guān)鍵因素之一。紫杉醇是一種微管抑制劑，主要抑制細(xì)胞周期的G0/G1期和G2/M 期，抑制紡錘體形成以及與細(xì)胞分裂有關(guān)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表

3、達(dá)，從而抑制所有依賴微管的細(xì)胞生理過(guò)程，包括增殖、遷移和分泌功能，毫微克分子濃度的紫杉醇即能有效抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行。紫杉醇藥物涂層支架在抑制平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞，延遲了血管內(nèi)皮化進(jìn)程，可導(dǎo)致亞急性和遲發(fā)性血栓形成。支架血栓形成是DES的災(zāi)難性并發(fā)癥，盡管支架血栓形成的發(fā)生率較低，但其后果嚴(yán)重，死亡率較高，是PCI 最主要的死亡原因之一，如何把血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)降至最低是目前國(guó)內(nèi)外研究抗增殖藥物的焦點(diǎn)和前沿領(lǐng)域

4、。
　　 PCI 圍術(shù)期血栓形成的機(jī)制主要包括兩個(gè)環(huán)節(jié)：凝血酶活化和血小板激活，其中凝血反應(yīng)在該過(guò)程中發(fā)揮承上啟下的作用。凝血酶除了將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白參與凝血過(guò)程外，還通過(guò)激活凝血酶受體引發(fā)直接或者間接凝血酶介導(dǎo)的分子和細(xì)胞間的相互作用。伴隨凝血過(guò)程的瀑布式反應(yīng)，凝血酶既能使內(nèi)皮通透性增強(qiáng)，引發(fā)一系列血管損傷反應(yīng)；凝血酶又具有生長(zhǎng)激素樣作用，促進(jìn)血管損傷后的增殖反應(yīng)；同時(shí)還與血小板、蛋白激酶和粘附分子等形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)連接

5、，因而凝血酶在再狹窄過(guò)程中既起著重要的始動(dòng)作用，又貫穿于全過(guò)程。水蛭素是直接凝血酶抑制劑，與肝素不同，水蛭素對(duì)凝血酶的抑制和滅活作用不依賴于抗凝血酶Ⅲ、肝素輔助因子Ⅱ、蛋白C 或組織因子途徑抑制物，且不被血小板結(jié)合而失活，有抑制凝血酶誘發(fā)的血小板聚集作用，因此具有良好的抗凝和抗血栓作用。
　　 本課題通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)體外探討紫杉醇水蛭素復(fù)合物對(duì)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，尋找二者能夠最大限度抑制平滑肌細(xì)胞、最小限度抑制

6、內(nèi)皮細(xì)胞的合適比例，為研發(fā)紫杉醇水蛭素復(fù)合藥物支架提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 方法:
　　 用體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞第3～5代，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)加入不同濃度的水蛭素0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00ug/ml，每6孔為一個(gè)濃度組，1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，共7組，培養(yǎng)48 h后用

7、MTT 法(噻唑藍(lán)比色試驗(yàn))測(cè)定各孔貼壁細(xì)胞的吸光度A值（absorption，吸光度）。
　　 結(jié)果:
　　 與空白對(duì)照組相比，0.78～6.25 ug/ml濃度組水蛭素作用于體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，貼壁良好，生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用（p>0.05）；12.50、25.00ug/ml濃度組水蛭素作用于體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞密度減小，生長(zhǎng)呈現(xiàn)抑制作用（p<0.05）；水蛭素作用于兔血管平滑肌細(xì)

8、胞后，與空白對(duì)照組相比，0.78、1.56 ug/ml濃度組水蛭素對(duì)平滑肌細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，3.13～25.00ug/ml濃度組水蛭素作用于平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞密度有所減小、排列松散，A值下降，呈現(xiàn)抑制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)（p值均<0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 0.78～6.25ug/ml水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用，12.50～25.00ug/ml水蛭素可明顯抑制兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)；0.78～1.5

9、6 ug/ml水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)兔血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，3.13～25.00ug/ml水蛭素可抑制兔血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 第二部分 紫杉醇水蛭素復(fù)合物對(duì)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 方法:
　　 用體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞第3～5代，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，根據(jù)加入藥物分為五組:①空白對(duì)照組：采用1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照組；②紫杉醇對(duì)照組：1umol/L；③小劑量復(fù)合藥物組

10、（紫杉醇1umol/L+水蛭素3.13ug/ml）；④中劑量復(fù)合藥物組（紫杉醇1umol/L+水蛭素4.50ug/ml）；⑤大劑量復(fù)合藥物組（紫杉醇1umol/L+水蛭素6.25ug/ml），每6孔為一個(gè)濃度組, 共同培養(yǎng)48 h后用MTT 法(噻唑藍(lán)比色試驗(yàn))測(cè)定各孔貼壁細(xì)胞的吸光度A值（absorption，吸光度）。
　　 結(jié)果:
　　 與紫杉醇單藥組相比，紫杉醇加用小劑量水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著性