胚胎干細胞向心肌細胞分化中內皮細胞的作用.pdf

1、研究背景和目的:在缺血性心臟疾病中，細胞移植治療具有廣闊的前景，而具有多項分化潛能的胚胎干細胞作為一種具有治療作用的組織，擁有巨大的臨床應用潛力。最近，很多研究都指出胚胎干細胞來源的內皮細胞對于缺血性心臟疾病可能有治療作用。眾所周知，心肌細胞生活在血管系統(tǒng)微環(huán)境中，心肌細胞和內皮細胞在發(fā)育過程中，幾乎同時從生心中胚層中產生，但迄今為止，沒有直接證據(jù)證明兩者在胚胎干細胞分化過程中有著功能性的聯(lián)系。本研究通過添加外源性內皮細胞和抑制內源性內

2、皮細胞的方法，觀察胚胎干細胞向心肌細胞分化這一過程的變化，從而為胚胎干細胞分化過程中這兩種細胞之間的關系提供直接的證據(jù)，為今后內皮細胞應用于臨床心臟疾病提供細胞學方面的依據(jù)。 方法：采用常規(guī)懸滴培養(yǎng)分化的方法，借助CGR8-GFP這一熒光蛋白檢測小鼠胚胎干細胞系心肌特異性的肌球蛋白重鏈（α－MHC）的表達情況觀察胚胎干細胞向心肌細胞分化過程。第一個實驗是添加入不同數(shù)量的外源性內皮細胞和成纖維細胞，觀察胚胎干細胞分化所得心肌細胞數(shù)

3、量的變化。第二個實驗是添加內皮細胞特異性抑制劑－Endostatin，觀察當內源性內皮細胞被抑制后，胚胎干細胞分化為心肌細胞數(shù)量的變化。第三個實驗是在添加內皮細胞特異性抑制劑Endostatin的基礎上，再次加入不同數(shù)量的外源性內皮細胞，觀察胚胎干細胞分化所得心肌細胞數(shù)量的變化。 結果： 1、在胚胎干細胞的分化過程中，相比加入外源性成纖維細胞（NIH3T3，小鼠胚胎成纖維細胞－MEFs），加入外源性內皮細胞（人類骨髓微血

4、管內皮細胞－BMECs，人類臍靜脈內皮細胞－ HUVECs）后，心肌細胞形成明顯增多。BMECs的作用相對比較穩(wěn)定，但存在細胞數(shù)量依賴效應：200個BMECs，是早期獲得大量心肌細胞的最少外源性內皮細胞數(shù)。 2、當使用特異性內皮細胞抑制劑－Endostatin時，在內源性內皮細胞被抑制的同時，心肌細胞的形成也明顯減少。Endostatin存在劑量依賴效應，2ug/ml能夠明顯抑制內皮細胞和心肌細胞。第0天加入endostatin

5、，第10天或者第15天收集分化的擬胚體，無論是心肌細胞還是內皮細胞的標記物，在基因水平和蛋白質水平表達都明顯下調。 3、外源性內皮細胞與胚胎干細胞的共培養(yǎng)能夠挽救由于內源性內皮細胞抑制（由Endostatin所介導）而導致的心肌細胞形成障礙。在分化的第9天，在添加200個外源性內皮細胞（BMECs）的組中，無論是否添加endostatin，都出現(xiàn)了跳動的心肌細胞團，在每組72個擬胚體中，加入endostatin組出現(xiàn)了9個（12