丹參及其三種單體成分體外誘導(dǎo)胚胎干細胞向心肌細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:心血管疾病是目前威脅人類健康的主要疾病之一,各種病因?qū)е碌男募〖毎蛉毖?、缺氧而凋亡、壞死、纖維化,進而數(shù)量減少,最終心泵功能下降是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。隨著人類對干細胞認識的不斷深入,利用于細胞的增殖分化潛能,再生心肌細胞,修復(fù)受損心肌組織,恢復(fù)心臟功能,已成為治療心血管疾病尤其是心功能衰竭的一種新策略。
　　 在心肌再生研究中,應(yīng)用的干細胞主要包括胚胎干細胞(ESCs)和成體干細胞(ASCs)。其中,ESCs分離于早

2、期胚胎的內(nèi)細胞團(ICM),具有自我更新、體外無限增殖、保持正常染色體核型和未分化狀態(tài)等特性。ESCs在體內(nèi)外正常分化時,能產(chǎn)生3個胚層來源的所有細胞類型。因此,相對于某些成體干細胞而言,ESCs是全能性細胞,更易于體外擴增,分化效率較高且穩(wěn)定。在體外特定培養(yǎng)條件下,ESCs可特異地向某種組織類型的細胞進行分化,其中包括向心肌細胞的分化。然而,限制ESCs來源的心肌細胞在心臟再生治療臨床應(yīng)用中的一個主要障礙,就是心肌的低分化率所導(dǎo)致的心

3、肌細胞數(shù)量不足。由于ESCs自發(fā)性分化為心肌細胞的比率很低(約0.2％～0.5％),使得相關(guān)化學誘導(dǎo)劑和細胞因子被先后應(yīng)用于誘導(dǎo)研究,以提高心肌細胞的分化率。
　　 丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖,作為我國傳統(tǒng)中藥,其在臨床上用于防治心腦血管疾病已有多年。臨床觀察和動物實驗均證實丹參具有廣泛而復(fù)雜的藥理學活性,包括改善微循環(huán),清除自由基,抑制血小板聚集和抗血栓形成

4、等作用,并可通過擴張冠脈、增加冠脈血流量、防止心肌缺血、減輕鈣超載,改善能量代謝等途徑來保護心肌組織。丹參含有多種化學成分,一般按性質(zhì)可分為水溶性(主要為丹酚酸類)和脂溶性(主要為丹參酮類)兩大類。丹酚酸類和丹參酮類化合物都是丹參的主要有效成分,在藥理作用方面,丹參酮類化合物以改善血液循環(huán)、抗菌和抗炎作用為主;而丹酚酸類化合物則以抗氧化、抗凝血和細胞保護作用特別突出。
　　 本實驗選取ESCs作為研究對象,通過檢測丹參及其單體成

5、分丹參素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B在誘導(dǎo)ESCs向心肌細胞分化過程中,各組心肌細胞的分化率、形態(tài)學、分子生物學、機能學等方面的特性,探討丹參及其單體成分對心肌細胞分化的影響,以期為丌發(fā)丹參在臨床上新的應(yīng)用,以及我國傳統(tǒng)中藥介入再生醫(yī)學、組織工程等領(lǐng)域提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、ESCs的培養(yǎng)與擴增將小鼠CGR8胚胎干細胞接種于預(yù)先包被有0.2％明膠的培養(yǎng)皿中,應(yīng)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5％C

6、O2及飽和濕度條件下培養(yǎng),隔日換液,待細胞集落80％～90％融合時傳代。
　　 2、擬胚體的制備與分化培養(yǎng)以含20％胎牛血清的IMDM為分化培養(yǎng)基,將ESCs制成濃度為4～5×104個/ml的細胞懸液,采用懸滴法("hanging drop")培養(yǎng)形成擬胚體,于擬胚體形成的第4～8d分別向培養(yǎng)液中加入丹參(10mg/ml)、丹參素(10μg/ml)、丹參酮ⅡA(5μg/ml)和丹酚酸B(1μg/ml)進行誘導(dǎo)分化。對照組僅用分化

7、培養(yǎng)液培養(yǎng)。此后隔同換液,直至檢測。
　　 3、細胞增殖和細胞毒性檢測將ESCs以5000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,置孵箱內(nèi)培養(yǎng),待其貼壁后分別加入誘導(dǎo)劑量的各組藥物,設(shè)置空白對照。于孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后進行檢測,具體步驟按照MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書進行操作,酶標儀檢測波長550nm處各孔的吸光度(OD)值。
　　 4、細胞周期和細胞凋亡檢測向?qū)?shù)生長期的ESCs中分別加入誘導(dǎo)劑量的各組藥物,設(shè)置空

8、白對照,于孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后進行檢測,具體步驟按照細胞周期及細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,流式細胞儀分析檢測。
　　 5、計數(shù)Ebs分化率每日于顯微鏡下觀察各組Ebs的生長情況及出現(xiàn)跳動細胞的時間,以各組Ebs中出現(xiàn)跳動的心肌合胞體為分化陽性,并分別與每組Ebs的總數(shù)相比,所得百分比即為Ebs的自發(fā)搏動率,即Ebs分化率。
　　 6、流式細胞分析收集分離于Ebs的單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml,以小鼠抗

9、小鼠cardiac troponin T單克隆抗體為一抗,FITC標記的山羊抗小鼠IgG為二抗,設(shè)置空白對照,流式細胞儀檢測分析。
　　 7、Ebs的免疫熒光檢測取各組形成第13d的Ebs,棄去培養(yǎng)基,PBS洗3次,4％多聚甲醛固定30min,0.2％Triton X-100透化20min,5％BSA封閉30min,以小鼠抗小鼠α-actinin為一抗,FITC標記的山羊抗小鼠IgG為二抗,Hoechst33258染核,熒光抗淬

10、滅劑封片后,倒置熒光顯微鏡下觀察。
　　 8、分化心肌細胞的免疫熒光檢測取分離于各組Ebs并貼壁伸展后的細胞,棄液、清洗、固定、透化、封閉,一抗為兔抗小鼠cardiac troponinⅠ抗體,二抗為FITC標記山羊抗兔IgG,Hoechst33258染核封片后,倒置熒光顯微鏡下觀察。
　　 9、雙標法檢測分化心肌細胞的特異性蛋白抗原取分離于Ebs并貼壁伸展后的細胞,棄液、清洗、固定、透化、封閉后,同時加入兔抗小鼠car

11、diac troponinⅠ和小鼠抗小鼠α-actinin作為一抗,以FITC標記的山羊抗兔IgG和PE標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗,激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 10、RT-RCR檢測MLC-2v、α-MHC和Anf的Mrna的表達提取第13d跳動Ebs的總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄為Cdna,PCR方法進行擴增,產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。
　　 結(jié)果:
　　 1、分化后細胞形態(tài)及各組Ebs的分

12、化率 ESCs經(jīng)懸滴培養(yǎng)48h后形成白色的Ebs,貼壁培養(yǎng)4～5d后,于倒置顯微鏡下可觀察到Ebs周邊部出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性收縮的心肌細胞團,不同Ebs或同一EB中不同部位的心肌合胞體,其形態(tài)和收縮節(jié)律不盡相同。第13d各組Ebs的分化率分別為丹參組80.21％,丹參素組71.52％,丹參酮ⅡA組65.97％,丹酚酸B組61.46％,與對照組(58.33％)比較均有顯著性差異。
　　 2、流式細胞分析各組分離于Ebs的單細胞中,以丹

13、參組的心肌特異性肌鈣蛋白T陽性(cTnT+)細胞數(shù)所占百分比最高,達56.23‰,與對照組(28.47‰)相比,提高心肌細胞分化率達198±58％。丹參素組、丹參酮ⅡA組、丹酚酸B組的心肌細胞分化率分別為51.33‰、45.00‰和34.13‰,與對照組相比提高心肌細胞分化達180±25％、158±34％和120±60％。
　　 3、免疫熒光檢測各組分化培養(yǎng)13d的Ebs經(jīng)α-actinin染色呈陽性,同時,cardiac tr

14、oponinⅠ的表達,在從第13d各組Ebs中分離出的分化心肌細胞內(nèi)也能被觀察到。
　　 4、誘導(dǎo)劑量的各組藥物對ESCs細胞周期和細胞增殖的影響流式細胞分析顯示,對數(shù)生長期的ESCs大部分處于S期,誘導(dǎo)劑量的各組藥物對細胞周期無顯著影響,且不誘導(dǎo)細胞凋亡的產(chǎn)生。MTT法結(jié)果顯示,丹參素組、丹參酮ⅡA組、丹酚酸B組所測OD值與對照組比較有顯著性差異,即誘導(dǎo)劑量的各組藥物對ESCs無毒性作用,且丹參素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B可促進E

15、SCs的增殖。
　　 5、ESCs來源的心肌細胞的分子生物學特征在分化培養(yǎng)第12d跳動的Ebs中,可見成熟心肌細胞特征性基因MLC-2v、α-MHC和Anf的表達。激光共聚焦顯微鏡下,心肌細胞特征性肌絲結(jié)構(gòu)在ESCs來源的心肌細胞內(nèi)清晰可見。
　　 結(jié)論:
　　 1、丹參及其單體成分丹參素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B均可不同程度地提高ESCs向心肌細胞的分化率,且丹參的促分化作用顯著高于三種單體成分。
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