APJ基因在人胚胎干細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化過程中表達(dá)特征的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:化學(xué)成分明確的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的:
　　以E8培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，ESCs），探索化學(xué)成分明確的 CDM3誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基在人 ESCs定向心肌細(xì)胞分化中的作用及最佳細(xì)胞接種密度。
　　研究方法:
　　人ESCs細(xì)胞復(fù)蘇后傳代3次，接種至鋪有生長因子減量的Matrigel膠上，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%

2、左右時(shí)，換用CDM3誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化的d0-d2加入6umol/L CHIR99021，d3-d4加入2umol/L Wnt-59，之后單用CDM3培養(yǎng)基，直至開始出現(xiàn)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)分化過程中觀察細(xì)胞形態(tài)及跳動(dòng)心肌細(xì)胞數(shù)量的變化。再分別以0.5×104、1×104、1.5×104、2×104個(gè)/cm2的接種密度分別進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，觀察不同接種密度ESCs定向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率。
　　研究結(jié)果:
　　誘導(dǎo)d

3、7開始出現(xiàn)跳動(dòng)的細(xì)胞，跳動(dòng)細(xì)胞數(shù)量d7-d16逐漸增加，d16達(dá)高峰。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：跳動(dòng)細(xì)胞心肌特異性標(biāo)志物a-Actinin、cTNNT2表達(dá)陽性，并可見明顯的肌節(jié)及潤盤結(jié)構(gòu)；ESCs接種密度為0.5×104個(gè)/ cm2時(shí)不能成功誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞，接種密度為2×104個(gè)/cm2的誘導(dǎo)效率較密度為1×104、1.5×104個(gè)/cm2者低。
　　結(jié)論:
　　CDM3誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基可以成功誘導(dǎo)人 ESCs定向分化為心肌細(xì)胞

4、，1-1.5×104個(gè)/cm2為誘導(dǎo)分化的最佳接種密度。
　　第二部分:人胚胎干細(xì)胞定向心肌分化過程中APJ表達(dá)特征的研究
　　研究目的:
　　人ESCs定向心肌分化過程中，以中胚層階段、心肌細(xì)胞起始分化階段、心肌細(xì)胞后分化階段為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，探索APJ的表達(dá)特征。
　　研究方法:
　　經(jīng)單層培養(yǎng)后，應(yīng)用化學(xué)成分明確的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)人ESCs向心肌細(xì)胞分化，于中胚層階段（d2）、心肌細(xì)胞起始分化階段（d

5、3）、心肌細(xì)胞后分化階段(d7)分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，共聚焦顯微鏡觀察Brachyury T、mesp1、Nkx2.5與APJ的蛋白表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）法檢測四種標(biāo)志物mRNA的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　誘導(dǎo)d7開始出現(xiàn)跳動(dòng)的細(xì)胞，跳動(dòng)細(xì)胞數(shù)量d7-d16逐漸增加，d16達(dá)高峰。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示： APJ在 d2、d3、d7三個(gè)階段分別與階段特異性標(biāo)志物Brachyury