三氯乙烯抑制人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討三氯乙烯(TCE)對(duì)人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　以人胚胎干細(xì)胞H9體外心肌定向分化為基礎(chǔ)，培養(yǎng)液中添加不同劑量的TCE（處理組分別為：100 ppb組，1 ppm組，10 ppm組）以及二甲基亞砜（DMSO，對(duì)照組）。對(duì)誘導(dǎo)后形成的擬胚體以及不同發(fā)育階段的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)：MTT法測(cè)定細(xì)胞生存力，直觀統(tǒng)計(jì)擬胚體自主節(jié)律性搏動(dòng)次數(shù)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞分化比例，熒光定量PCR

2、檢測(cè)心肌特異性基因表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)各個(gè)時(shí)期相關(guān)蛋白表達(dá)，基因芯片法觀察TCE對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.胚胎干細(xì)胞向心肌成功定向分化
　　隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞依次經(jīng)過(guò)多能干細(xì)胞期，擬胚體懸浮期以及自發(fā)節(jié)律性搏動(dòng)的貼壁擬胚體形成期?？梢杂^測(cè)到胚胎干細(xì)胞(ESC)形態(tài)發(fā)生變化，用階段特異性標(biāo)記物作RT-PCR，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞分化成功。
　　2.TCE的細(xì)胞毒性作用
　　M

3、TT法顯示，所檢測(cè)的濃度對(duì)于未分化的胚胎干細(xì)胞和終末分化的心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性均不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用(n=12,P>0.05)。說(shuō)明所用劑量的TCE本身不影響細(xì)胞活性。
　　3.TCE抑制人胚胎干細(xì)胞的心肌定向分化
　　隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，觀測(cè)到的擬胚體搏動(dòng)數(shù)目增加，自發(fā)搏動(dòng)擬胚體發(fā)生的時(shí)間比對(duì)照組向后推移，流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，隨著TCE濃度增加，心肌特異性標(biāo)志物cTnt的陽(yáng)性率不斷降低，表明TCE對(duì)于心肌分化的抑制具有

4、明顯的劑量依賴性。
　　收集培養(yǎng)D21的各組劑量處理的細(xì)胞，用免疫熒光法檢測(cè)cTnt蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞受累區(qū)域明顯增大。
　　4.TCE抑制心肌分化階段標(biāo)志物的表達(dá)
　　TCE對(duì)于多能基因Nanog、Tert和Sox2、中胚層形成相關(guān)基因Gata4和T的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05)。但TCE能夠顯著影響成熟期心肌標(biāo)志物cTnt和Mhy-7的表達(dá)水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性下調(diào)，說(shuō)明TCE影響心肌細(xì)胞從心肌前

5、體期到成熟心肌分化的轉(zhuǎn)變。
　　5.TCE對(duì)心肌鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　q-PCR結(jié)果顯示鈣離子通道相關(guān)基因Serca2和Cav1.2表達(dá)水平顯著下調(diào)，說(shuō)明TCE干擾心肌細(xì)胞鈣離子通道基因的表達(dá)。
　　將具有自主性節(jié)律搏動(dòng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行芯片分析，發(fā)現(xiàn)這些能夠自主搏動(dòng)的細(xì)胞其鈣離子通道相關(guān)基因的數(shù)目總體呈現(xiàn)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　三氯乙烯抑制心臟祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化過(guò)渡，降低成熟心肌分化的比例，干