解決人胚胎干細(xì)胞免疫排斥的方法研究——人胚胎干細(xì)胞建庫與孤雌胚胎干細(xì)胞的建立.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)是從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass,ICM)分離得到,能夠在體外無限增殖并且保持核型穩(wěn)定,在特定的誘導(dǎo)條件下還可以向三個胚層的任何細(xì)胞類型分化。因此,hESCs不僅是研究人類胚胎發(fā)育的最佳模型,也是未來再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用上極富前景的種子細(xì)胞來源。但是hESCs及其分化后的功能細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性抗原(MajiorHistocompatibility

2、 Complex,MHC),移植到宿主體內(nèi)后可能因MHC不相容而刺激機(jī)體引起免疫排斥反應(yīng),導(dǎo)致移植治療失敗,這將成為hESCs未來臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一。因此,要實(shí)現(xiàn)hESCs及其功能產(chǎn)物安全應(yīng)用的關(guān)鍵之一就是如何解決免疫排斥問題。本研究主要從兩個方面探討克服干細(xì)胞移植的免疫排斥障礙的策略:建立胚胎干細(xì)胞庫進(jìn)行MHC配型；建立孤雌胚胎干細(xì)胞系,一方面更容易得到HLA純合的胚胎干細(xì)胞系從而提高干細(xì)胞庫的MHC配型效率,另一方面也是女性患者

3、自身特異性的多能性干細(xì)胞。全文共包括2個部分,分述如下:
　　 目的:探討能否利用質(zhì)差或者異常受精的胚胎建立胚胎干細(xì)胞庫,以及建立的胚胎干細(xì)胞庫用于干細(xì)胞移植時HLA匹配的可行性。
　　 方法:利用體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療中的廢棄胚胎建立人類胚胎干細(xì)胞庫,包括:異常原核的胚胎、受精后第三天觀察質(zhì)量較差的胚胎、植入前遺傳學(xué)診斷異常(PGD)的胚胎。對建立的胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)致全面的特性鑒定以及HLA和ABO基

4、因分型檢測。然后與中華骨髓庫湖南分庫中隨機(jī)選擇的5236名正常人群進(jìn)行HLA匹配分析。
　　 結(jié)果:共采用692枚囊胚,建立了188個hESCs系,這些細(xì)胞系均具有胚胎干細(xì)胞的典型特征,其中153(81.4％)株具有正常二倍體核型。具有二倍體HLA基因型的174株hESCs系與5236名假想患者進(jìn)行了HLA配型分析,結(jié)果表明:這些hESCs系能夠為24.94％-56.26％的假想患者提供良好的HLA匹配,并且匹配率的高低與民族差

5、異無關(guān)。此外,8個HLA純合型hESCs系貢獻(xiàn)了細(xì)胞庫不同HLA匹配水平上50-80％的匹配效率。
　　 結(jié)論:利用臨床廢棄胚胎能夠建立人胚胎干細(xì)胞庫,并且能夠具有較大的HLA配型價值,為解決干細(xì)胞移植的免疫排斥問題提供了一個良好的策略。
　　 目的:通過孤雌激活的方法建立患者特異性胚胎干細(xì)胞系,并與正常受精來源的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性的比較研究,探討孤雌胚胎干細(xì)胞是否與正常受精胚胎干細(xì)胞一樣具有巨大的臨床應(yīng)用前景。<

6、br>　　 方法:利用人工孤雌激活的胚胎以及IVF-ET過程中自然孤雌激活的1PN胚胎建立孤雌胚胎干細(xì)胞(Parthenogenetic embryonic stem cells,pESCs)系,對pESCs系進(jìn)行細(xì)致全面的干細(xì)胞特性鑒定。并從三個方面對pESCs系與正常受精hESCs系進(jìn)行比較研究,包括:印記基因的表達(dá)、全基因組范圍內(nèi)基因表達(dá)差異的分析、全基因組SNP的分布特點(diǎn)以及三個胚層主要器官發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)對比分析。

7、　　 結(jié)果:pESCs僅表達(dá)母源性印記基因,父源性印記基因沉默,而正常受精hESCs同時表達(dá)父源和母源印記基因。在全基因組SNP分布方面,自然激活孤雌胚胎來源的chHES-32表現(xiàn)為絕大多數(shù)位點(diǎn)純合,人工激活孤雌胚胎來源的chHES-69表現(xiàn)為大片段的純合與雜合并存,而正常受精胚胎的chHES-8和chHES-10表現(xiàn)為絕大多數(shù)位點(diǎn)雜合。將pESCs和正常hESCs制備EB,體外自發(fā)分化21天后,通過RT-PCR.以及Real-tim