牛胚胎干細(xì)胞技術(shù)研究.pdf

1、牛胚胎干細(xì)胞一直未能成功建系，在其培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的選擇、飼養(yǎng)層的選擇、獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的途徑等等多種因素影響著牛胚胎干細(xì)胞的生長。確定一種適合的培養(yǎng)體系及傳代方法對牛胚胎干細(xì)胞的成功建系有著非常重要的意義。本研究從制備飼養(yǎng)層、確定傳代方法及培養(yǎng)液中抑制分化因子的添加等幾個方面來確定適合于來自體外受精胚胎的牛類胚胎干細(xì)胞的生長體系，并采用形態(tài)鑒定、堿性磷酸酶染色、類胚體形成，免疫熒光染色等方法對牛類胚胎干細(xì)胞進(jìn)行檢測。
　　 1.采

2、用胰酶消化法和組織塊貼壁法分別獲得原代胎鼠和牛胎兒成纖維胞，運用三種不同的傳代方法和四種不同的冷凍復(fù)蘇方法對兩種成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示使用方法一（不對其離心，細(xì)胞剛剛消化變圓便將胰酶吸出，再進(jìn)行傳代）對成纖維細(xì)胞傳代時，細(xì)胞貼壁率較高、后期的培養(yǎng)中細(xì)胞生長活力較好；使用方法四（復(fù)蘇后不離心，在細(xì)胞貼壁后及時更換細(xì)胞的培養(yǎng)液）對成纖維細(xì)胞冷凍復(fù)蘇時，細(xì)胞的貼壁率較高且形態(tài)較好，在后期的生長中活力也較好。所以，采用方法一對成纖維細(xì)胞傳

3、代、方法四對其冷凍復(fù)蘇有利于成纖維細(xì)胞的生長。
　　 2.在上述兩種成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的條件下，采用含10％胎牛血清、0.1mMβ-巰基乙醇、0.1mM非必須氨基酸、100IU/ml青霉素、0.05mg/ml鏈霉素、20ng/ml LIF和10ng/ml bFGF的DMEM F12培養(yǎng)液培養(yǎng)牛類胚胎干細(xì)胞，通過形態(tài)鑒定和堿性磷酸酶染色檢測來尋找一種適合于牛類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。結(jié)果顯示在相同的培養(yǎng)體系條件下培養(yǎng)牛類胚胎干細(xì)胞

4、，以胎鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的貼壁率顯著高于以牛胎兒成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的貼壁率（P<0.05），且后期的生長狀態(tài)較好。結(jié)果表明以胎鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層有利于牛類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　 3.在以胎鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的條件下，采用含10％胎牛血清、0.1mMβ-巰基乙醇、0.1mM非必須氨基酸、100IU/ml青霉素、0.05mg/ml鏈霉素、20ng/ml LIF和10ng/ml bFGF的DMEM F12培養(yǎng)液，使用機械傳代法

5、和胰酶消化法培養(yǎng)牛類胚胎干細(xì)胞。結(jié)果顯示采用機械傳代法益于牛類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)，而胰酶消化法傳代牛類胚胎干細(xì)胞最多傳至第三代即分化消失。結(jié)果表明在牛類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)時機械傳代法更利于其生長。
　　 4.以胎鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，采用機械傳代法傳代，用三種不同的培養(yǎng)液（即培養(yǎng)液中添加20ng/ml LIF、10ng/ml SCF+20ng/ml LIF、10ng/ml SCF）培養(yǎng)牛類胚胎干細(xì)胞，來確定LIF、SCF因子對牛類胚

6、胎干細(xì)胞培養(yǎng)的影響，從而為尋找牛胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的合適因子奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，添加10ng/mlSCF+20ng/ml LIF的培養(yǎng)液的胚胎貼壁率明顯高于添加10ng/ml SCF的培養(yǎng)液（P<0.05）；添加20ng/ml LIF的培養(yǎng)液與添加10ng/ml SCF+20ng/ml LIF和10ng/mlSCF的培養(yǎng)液的胚胎貼壁率均無明顯差異；在后期的傳代培養(yǎng)過程中添加20ng/ml LIF和添加10ng/ml SCF+20ng/ml