TGF-β信號(hào)與胚胎-胚胎干細(xì)胞造血調(diào)控.pdf

1、TGF-β分子通過對關(guān)鍵靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)節(jié)多種前體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和移行。原始和永久造血的有序發(fā)生是胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)及胚胎造血的共同特點(diǎn)。迄今，TGF-β、受體及下游信號(hào)分子SMAD在ES細(xì)胞/胚胎造血發(fā)育中的作用尚未明了。 結(jié)果:一.TGF-β1在成血-血管細(xì)胞(Hemangioblast)發(fā)生和分化中發(fā)揮不同作用。成血-血管細(xì)胞具有向造血和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。間接證據(jù)認(rèn)為：小鼠胚胎期(ED)7.0-7.5

2、天的卵黃囊血島結(jié)構(gòu)由成血-血管細(xì)胞分化產(chǎn)生?；蚯贸Ｐ桶l(fā)現(xiàn)：TGF-β1、TGF-β受體Ⅱ型和TGF-β受體Ⅰ型缺失均可導(dǎo)致卵黃囊血島發(fā)育缺陷，提示TGF-β信號(hào)可能參與成血-血管細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)。鑒于目前無確鑿證據(jù)證實(shí)卵黃囊階段成血-血管細(xì)胞的存在，因此ES細(xì)胞/BL-CFC分化模型是研究成血-血管細(xì)胞發(fā)育的最佳模型。本研究首先建立了ES細(xì)胞/BL-CFC分化模型。應(yīng)用無血清分化體系，小鼠ES細(xì)胞系TC1在BMP4的刺激下分化5天可形

3、成中胚層細(xì)胞：F1k-1+細(xì)胞(3％)，但不能產(chǎn)生BL-CFC。類似的，TC1在血清/膠原貼壁分化體系中培養(yǎng)4天可高效形成Flk-1+細(xì)胞(15-20％)，但仍不產(chǎn)生BL-CFC。血清體系中，TC1懸浮分化3天形成的擬胚體中含有BL-CFC(60個(gè)/1*105細(xì)胞)，后者在分化體系中形成形態(tài)典型的Blast集落。巢式RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：單個(gè)Blast集落表達(dá)造血(GATA-1，胚胎珠蛋白)和內(nèi)皮特異性基因Tie-2。免疫熒光發(fā)現(xiàn)：Bl

4、ast集落來源的貼壁細(xì)胞表達(dá)CD31、VE-Cadherin/CD144和UEA-Ⅰ，并可特異性吞噬低密度脂蛋白(LDL)，證明其為內(nèi)皮細(xì)胞。單個(gè)Blast集落的造血培養(yǎng)可產(chǎn)生原始紅系前體和多種永久造血前體：CFU-Mix，CFU-GM，BFU-E和HPP-CFC。隨后，應(yīng)用特異性中和抗體研究TGF-β1在成血-血管細(xì)胞發(fā)育中的作用。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)：體外分化2-6天的擬胚體表達(dá)TGF-β受體Ⅱ型和Smad2。在ES細(xì)胞初

5、始分化體系中加入TGF-β1特異性中和抗體并不改變過渡型前體(Transitionalprecursor，代表具有造血特化能力的中胚層細(xì)胞)的數(shù)量，但可顯著下調(diào)3天擬胚體中成血-血管細(xì)胞數(shù)量(p＜0.01)。而加入TGF-β1并不改變成血-血管細(xì)胞數(shù)量，但增加其造血祖細(xì)胞：CFC的分化效率。而在成血-血管細(xì)胞分化體系中，加入TGF-β1可顯著抑制Blast集落形成(p＜0.01)。此外，TGF-β1和TGF-β1特異性中和抗體顯著下調(diào)5

6、天擬胚體中原始紅系前體的數(shù)量(p＜0.01)。上述結(jié)果提示：TGF-β1在中胚層定向成血-血管細(xì)胞特化的過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用，卻抑制成血-血管細(xì)胞的造血和內(nèi)皮分化。 二.TGF-β1/Smad3在胎肝造血中無顯著調(diào)控作用。TGF-β1在體外可下調(diào)ED14.5胎肝細(xì)胞c-kit的表達(dá)，上調(diào)CD34分子的表達(dá)，但并不改變HPP-CFC集落形成能力。而后，我們分析了Smad3基因敲除小鼠ED14.5胎肝的表型。Westernblot

7、和免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)：胚胎期14.5天的胎肝細(xì)胞表達(dá)TGF-β受體及Smad2/Smad3。純合型(Smad3-/-)胎肝在造血干細(xì)胞比例(LSK比例)、HPP-CFC數(shù)量及8天CFU-S數(shù)量與野生型(Smad3+/+)無顯著差別。上述結(jié)果表明：TGF-β/Smad3對胎肝造血細(xì)胞的作用不顯著。 本研究初步研究了TGF-β1和Smad3在ES細(xì)胞/胚胎造血中的調(diào)控作用。然而，由于缺乏理想的研究模型和TGF-β/Smad信號(hào)通路