按人造血發(fā)育程序誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為造血干細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ESC)是具有自我更新和向機體三個胚層各種細(xì)胞分化潛能的原始細(xì)胞。自動物胚胎干細(xì)胞建系以來，定向造血分化就成為研究的熱點。1998年人類胚胎干細(xì)胞建系以后，在定向造血研究領(lǐng)域更加活躍。生物技術(shù)角度看，在將來有望可采用治療性克隆技術(shù)實現(xiàn)臨床惡性血液病(白血病、淋巴瘤等)、遺傳病(地中海貧血)和再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代治療。如能實現(xiàn)體外規(guī)模化大量生產(chǎn)造血干/祖細(xì)胞，則可最終解決臨

2、床移植中供體來源不足的難題。 本研究主要內(nèi)容分為以下幾個部分：1BMP4、VEGF促進(jìn)小鼠E14胚胎干細(xì)胞發(fā)育為富含造血前體細(xì)胞的擬胚體(embryoidbody,EB)(stepⅠ) 2不同造血位點基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系促進(jìn)擬胚體源性細(xì)胞進(jìn)一步分化為造血干細(xì)胞2.1人胚發(fā)育早期AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)擬胚體細(xì)胞造血分化發(fā)育(StepⅡ)2.2人胚孕中期胎肝基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)上述AGM誘導(dǎo)后細(xì)胞群向造血分化發(fā)育(StepⅢ)2.3人骨髓

3、基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)stepⅢ細(xì)胞進(jìn)一步向造血分化(StepⅣ) 3各組定向誘導(dǎo)條件下獲得造血干細(xì)胞的致瘤性檢測和成體動物造血重建實驗第一部分BMP4、VEGF對ESC向擬胚體發(fā)育過程中造血前體細(xì)胞的誘導(dǎo)作用1研究方法將小鼠E14胚胎干細(xì)胞維持生長于底層鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(murineembryonicfibroblast，MEF)飼養(yǎng)層的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每2～3天傳代培養(yǎng)，可保持良好的未分化狀態(tài)。 第二部分按胚胎發(fā)

4、育時空順序誘導(dǎo)EB細(xì)胞向造血干細(xì)胞發(fā)育分化ESC已經(jīng)在體外可被定向誘導(dǎo)為多種類型細(xì)胞，但已有造血定向分化的研究資料均顯示誘導(dǎo)效率不高，且分化時相控制較難，往往易得到分化終末期的細(xì)胞，如成熟的紅系、粒系及T、B淋巴細(xì)胞等，較難得到處于分化早期、能夠重建造血的HSC。因此，如何控制分化的時相，誘導(dǎo)、擴(kuò)增出大量處于分化早期的HSC，是目前ESC造血分化研究的重點。根據(jù)造血發(fā)生發(fā)育生物學(xué)知識，早期各造血位點的微環(huán)境對原始造血前體細(xì)胞向造血方向分

5、化具有重要的調(diào)節(jié)作用。這些造血微環(huán)境理論上對同樣處于原始分化狀態(tài)的ESC定向誘導(dǎo)造血也有類似的調(diào)節(jié)作用。本研究擬按照造血發(fā)生發(fā)育的時空順序，先將小鼠E14細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)育為EB。再依次在人胚胎早期確定造血的各發(fā)生發(fā)育位點，即AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞、胎肝造血期基質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，逐步觀察ESC向造血干細(xì)胞分化發(fā)育情況，分別檢測造血干細(xì)胞的比例和造血功能。期望進(jìn)一步誘導(dǎo)分化中獲得更高效、高產(chǎn)率的HSC，為研究ESC分化為HSC的分子機

6、制提供實驗?zāi)Ｐ?，并尋求?yōu)化體外ESC定向造血干細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件。 第三部分不同誘導(dǎo)體系(階段)的ESC來源HSC成體動物體內(nèi)造血重建實驗為了檢驗本研究上述不同誘導(dǎo)體系條件下獲得的各階段造血干細(xì)胞的體內(nèi)造血功能，進(jìn)一步將這些造血干細(xì)胞接種于放射致死劑量照射的成年雌性Balb/c小鼠，觀察受體小鼠的存活率、造血恢復(fù)情況及供體細(xì)胞植入能力。以此動物實驗進(jìn)一步判斷各分化發(fā)育階段的造血干細(xì)胞的體內(nèi)造血重建能力和安全性。