小鼠造血干細(xì)胞發(fā)育的功能異質(zhì)性研究.pdf

1、造血干祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）能夠每秒再生數(shù)以百萬(wàn)的血細(xì)胞，這一過(guò)程伴隨我們生命的始終。雖然造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）也能夠產(chǎn)生造血細(xì)胞，但是它不具備嚴(yán)格的自我更新的能力。作為整個(gè)造血系統(tǒng)的頂層設(shè)計(jì)者，只有造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新以及多向分化的能力。上世紀(jì)50年代，

2、越來(lái)越多的研究者開(kāi)始發(fā)掘HSC的表面標(biāo)志并且以多種標(biāo)志組合富集這一群體，著力通過(guò)體內(nèi)及體外的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)將HSC的起源、發(fā)育分化、調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題研究清楚。在各種HSC標(biāo)志組合提高了其富集效率的同時(shí)，HSC的異質(zhì)性特點(diǎn)也被發(fā)現(xiàn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，人們通過(guò)各種標(biāo)志組合富集的HSC，也許不能反映HSC的全貌，結(jié)果只是其中的代表性HSC或者是一部分HSC亞型。那么，這使人們針對(duì)HSC的起源、發(fā)育分化、調(diào)控機(jī)制的研究更加模糊。所以，HSC的異質(zhì)性問(wèn)題迫切需要

3、解決，才能將HSC的發(fā)育與再生研究透徹。此前，國(guó)外的研究者發(fā)現(xiàn)了小鼠發(fā)育過(guò)程中胚胎第14.5天（embryonic day14.5，E14.5）的胎肝階段至成體骨髓階段的HSC多種亞型，通過(guò)體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)描述了E14.5胎肝階段及3周以后的骨髓階段的HSC異質(zhì)性亞型發(fā)育動(dòng)力學(xué)及生理學(xué)特點(diǎn)。實(shí)際上，在胎肝最早發(fā)現(xiàn)的HSC主要由產(chǎn)生于其它生血位點(diǎn)的成熟 HSC隨血液循環(huán)遷移而來(lái)?；趦?nèi)皮造血轉(zhuǎn)化（endothelial to hemat

4、opoietic cell transition，EHT）的生血假說(shuō)，即內(nèi)皮細(xì)胞是造血細(xì)胞的起源，在HSC成熟之前，不成熟的HSC也被稱之為造血干細(xì)胞前體（pre-hematopoietic stem cell，pre-HSC），分為pre-HSCⅠ類（Type1）與pre-HSCⅡ類（Type2）。那么，在小鼠胚胎發(fā)育早期最重要的生血位點(diǎn)—主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)（aorta-gonad-mesonephros，AGM），不成熟的pre-

5、HSC及已經(jīng)成熟的HSC是否會(huì)包含兩種及以上的功能HSC亞型呢？是否在剛剛產(chǎn)生pre-HSC時(shí)就已經(jīng)決定了其異質(zhì)性亞型？pre-HSC和HSC的各種亞型的生物學(xué)特點(diǎn)又是什么？這些問(wèn)題都還未得到明確的答案。
　　首先，我們通過(guò)E11 AGM區(qū)新鮮細(xì)胞的極限稀釋（limit dilution assay，LDA）的直接移植，得到單克隆水平的重建受體后，收集成功重建受體的外周血，對(duì)使其重建的HSC進(jìn)行了追溯性分析。在得到的40個(gè)單克隆的

6、HSC直接移植后長(zhǎng)期重建的受體中，85％（34/40）的HSC表現(xiàn)為髓系相對(duì)缺陷分化的特性（γ-HSC），另外有15%（6/40）則為淋系髓系平衡型的HSC（β-HSC），未發(fā)現(xiàn)淋系相對(duì)缺陷型HSC（α-HSC）及髓系絕對(duì)缺陷型HSC（δ-HSC）。另外，在34個(gè)γ-HSC中，根據(jù)其發(fā)育動(dòng)力學(xué)特性，新發(fā)現(xiàn)了少部分的在髓系分化缺陷基礎(chǔ)上的合并 T淋巴細(xì)胞分化相對(duì)缺陷的γ-HSC（B-dominantγ-HSC），剩下的大部分被定義為平衡型

7、的γ-HSC（balancedγ-HSC）。通過(guò)與國(guó)際上報(bào)道的胎肝及成體骨髓階段HSC亞型的對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)胚胎早期AGM區(qū)的HSC亞型構(gòu)成比例有很大不同，各個(gè)亞型的特點(diǎn)也不盡相同。
　　其次，通過(guò)OP9-DL1共孵育后移植系統(tǒng)，獲得單個(gè)pre-HSC孵育后移植重建成功的受體，同樣追溯性地發(fā)現(xiàn)了pre-HSC的亞型及特點(diǎn)。在得到的單個(gè)pre-HSC成功重建的22個(gè)受體中，55%（12/22）展示為髓系相對(duì)缺陷分化特性的pre-HSC

8、（γ-pre-HSC），其余45%（10/22）為淋系髓系平衡型pre-HSC（β-pre-HSC）。同樣地，我們并未發(fā)現(xiàn)淋系相對(duì)缺陷型的α-pre-HSC及髓系絕對(duì)缺陷型的δ-pre-HSC。而且，在γ-pre-HSC中也出現(xiàn)了類似HSC亞型分布的B-dominantγ-pre-HSC亞型，并未發(fā)現(xiàn)pre-HSC發(fā)育階段的類型與pre-HSC亞型有對(duì)應(yīng)關(guān)系，即pre-HSC Type1與pre-HSC Type2在pre-HSC亞型分

9、布上類似。
　　至此，我們?cè)趩慰寺『蛦渭?xì)胞水平發(fā)現(xiàn)了最重要的發(fā)育位點(diǎn) AGM區(qū)的 HSC及 pre-HSC亞型構(gòu)成及特點(diǎn)，完善了小鼠胚胎發(fā)育時(shí)間軸上的異質(zhì)性問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于成體階段（8-12周的骨髓），胚胎階段（E11 Type1、E11 Type2、E14胎肝）高表達(dá)多個(gè)譜系分化相關(guān)的基因，提示胚胎階段可能是調(diào)控HSC多向分化或者決定成為不同亞型的關(guān)鍵時(shí)期。
　　最后，我們應(yīng)用Sm22a

10、-cre、ROSATMT、ROSAEYFP工具小鼠，在HSC發(fā)生的重要時(shí)間窗及位點(diǎn)，以Sm22a-cre標(biāo)記的間質(zhì)細(xì)胞可能構(gòu)成HSC發(fā)生的微環(huán)境為結(jié)合點(diǎn)，研究HSC異質(zhì)性亞型的發(fā)生機(jī)制。Sm22a雖然是平滑肌的標(biāo)志，但Sm22a-cre在E10.5至E11.5 AGM區(qū)及胎肝階段HSPC中均有表達(dá)，在內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化過(guò)程中的Tpye1 pre-HSC階段，也有類似于成體骨髓中CD45+細(xì)胞的表達(dá)比例（30%左右）。然而，在分選得到的Sm22

11、a-cre來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞群體與OP9-DL1共孵育后，雖然產(chǎn)生了較豐富的造血細(xì)胞簇，但移植后卻不能成功重建受體。而且，我們分選得到的Sm22a-cre來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞（代表AGM區(qū)腹側(cè)微環(huán)境細(xì)胞群體），與非Sm22a-cre來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞（代表AGM區(qū)背側(cè)微環(huán)境細(xì)胞群體），進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)前者的Bmp4表達(dá)量低。最后，我們應(yīng)用HSC群體細(xì)胞移植，區(qū)分 Sm22a-cre來(lái)源的骨髓 HSC，在得到的成功重建受體中

12、，未發(fā)現(xiàn)以Sm22a-cre區(qū)分的截然不同的HSC亞群特性，因此確定不能單純通過(guò)Sm22a-cre來(lái)源在骨髓HSC中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)不同的HSC的亞型。
　　綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)了在小鼠胚胎發(fā)育早期重要的造血發(fā)育位點(diǎn)AGM區(qū)，在內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化發(fā)生的時(shí)間窗內(nèi)，有兩種主要的HSC亞型，主要以髓系相對(duì)缺陷型的HSC為主，并且通過(guò)pre-HSC發(fā)育成熟而來(lái)，推測(cè)HSC異質(zhì)性亞型在pre-HSC階段就已經(jīng)被決定了。另外HSC與pre-HSC均未發(fā)現(xiàn)

13、淋系相對(duì)缺陷型及髓系絕對(duì)缺陷型的亞型。通過(guò)后續(xù)應(yīng)用Sm22a-cre在造血發(fā)生微環(huán)境的表達(dá)，發(fā)掘E10.5-E11.5 AGM區(qū)HSC亞型發(fā)生的機(jī)制問(wèn)題，無(wú)論從造血發(fā)生的空間異質(zhì)性（Sm22a-cre來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞代表的造血發(fā)生微環(huán)境），以及時(shí)間異質(zhì)性（來(lái)源于Sm22a-cre的不同發(fā)育時(shí)間及位點(diǎn)的表達(dá)），我們并未得到滿意的答案。重要的是，通過(guò)pre-HSC的單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)胚胎階段相比成體階段，對(duì)于HSC異質(zhì)性亞型的調(diào)控