造血干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)miRNAs的篩選及其功能初步研究.pdf

1、研究目的 1、研制新型哺乳動物miRNAs檢測芯片。 2、通過miRNAs芯片雜交，獲取CD34+CD38-造血干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)miRNAs表達(dá)譜。 3、生物信息學(xué)分析預(yù)測并驗證miRNAs作用靶點。 4、探索miRNAs在造血干細(xì)胞發(fā)育中的作用。 研究內(nèi)容和方法 1、研制新型哺乳動物miRNAs檢測芯片以己知哺乳動物基因組miRNAs序列為依據(jù)，合成相應(yīng)DNA探針，制作新型哺乳動物miRN

2、As檢測基因芯片。 2、CD34+CD38-造血干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)miRNAs表達(dá)譜的篩選流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選人臍血CD34+CD38-造血干細(xì)胞及CD34+造血祖細(xì)胞，提取其總RNA，分離純化18-100nt小片段RNA，經(jīng)擴增及熒光標(biāo)記后，與基因芯片進行分子雜交，獲得CD34+CD38-造血干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜。 3、實時熒光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)對miRNAs芯片結(jié)果的驗證選取6個在CD34+CD38-

3、造血干細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，以Q-RT-PCR加以驗證，對miRNAs芯片結(jié)果進行初步驗證，對結(jié)果一致的miRNAs行3次重復(fù)實驗以確證Q-RT-PCR結(jié)果的可靠性。 4、生物信息學(xué)分析及miRNAs作用靶點的驗證生物信息學(xué)分析miR-129、miR-526b*和miR-520h的染色體定位、保守性分析等，利用網(wǎng)絡(luò)共享軟件picTar、miRanda 3.0和targetscan3.1，分析其可能作用的靶基因。

4、選擇在CD34+CD38-差異較為顯著的miR-129、miR-520h的進行作用靶基因的驗證。首先合成與miRNAs結(jié)合的靶位點DNA序列及互補序列，并分別在兩條寡核苷酸5′端懸垂添加Hind Ⅲ和Spe Ⅰ酶切位點；退火形成形成帶酶切位點的雙鏈插入序列，與線性化pMIR-REPORT熒光素酶(Luc)報告基因載體(pMIR-Luc)連接構(gòu)建重組載體(pMIR-Luc-miR)，并進行酶切及測序驗證。 重組載體(pMIR-Lu

5、c-miR)、標(biāo)準(zhǔn)化對照載體pMIR-REPORT-β-gal(pMIR-β-gal)與miRNAs前體(Pre-miRNAs)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(實驗組)，72h后分別檢測HeLa細(xì)胞的熒光素酶(Luc)和β半乳糖苷酶(β-gal)的活性，計算二者的比值(Luc/β-gal)。同時設(shè)立三個對照組(no miRNA空白對照組、Pre-miR-negative陰性對照組和Anti-miRNAs反證對照組)，比較各組的Luc/β-gal比值

6、，驗證miRNAs作用靶點的真實性。 5、miR-520h促進造血發(fā)育功能研究選擇在CD34+CD38-造血干細(xì)胞中高表達(dá)的miR-520h，研究其在促進造血發(fā)育中的作用。流式細(xì)胞儀分選的CD34+細(xì)胞，miR-520h轉(zhuǎn)染CD34+細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h行CFC實驗檢測CD34+細(xì)胞集落形成能力改變，轉(zhuǎn)染后72h行FACS檢測CD34+、CD34+CD38-細(xì)胞比例變化，同時設(shè)立三個對照組(no miRNA空白對照組、Pre-mi

7、R-129陰性對照組和Anti-miR-520h反證對照組)，分析miR-520h在促進造血發(fā)育中的作用。 研究結(jié)果 1、成功研制新型哺乳動物miRNAs檢測芯片整個點陣分成4個亞陣，每個亞陣有23行，21列，點間距為185μm，點的直徑約為130μm。每條探針重復(fù)三次。為保證實驗的可靠性，在芯片的不同部位多次設(shè)定各種對照，經(jīng)點樣后芯片共有1754個位點，包含469個miRNAs序列，總共588個基因(每個基因重復(fù)3個位

8、點)。 2、CD34+CD38-造血干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)miRNAs的篩選與CD34+細(xì)胞miRNAs表達(dá)微陣列比較，HSC細(xì)胞共篩選出31個miRNAs，其中4倍低于CD34+細(xì)胞的miRNAs為22個(包括miR-129等)，4倍高于CD34+細(xì)胞的miRNAs為9個(包括miR-526b*和miR-520h等)，其中預(yù)測的miRNAs(PREDICTED MIR)為4個。 3、實時熒光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)

9、對miRNAs芯片結(jié)果的驗證選取6個CD34+CD38-造血干細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，以Q-RT-PCR加以驗證，與芯片結(jié)果的吻合率達(dá)到50％，兩種實驗結(jié)果相符的miRNAs為：CD34+CD38-造血干細(xì)胞低表達(dá)的miR-129和CD34+CD38-造血干細(xì)胞中高表達(dá)的miR-526b*和miR-520h，相對于CD34+細(xì)胞的相對表達(dá)率分別為0.160±0.005、2.276±0.058和5.596±0.861。 4、

10、生物信息學(xué)分析及miRNAs作用靶點的驗證利用在線軟件Pictar、miRanda 3.0和targetscan3.1分別預(yù)測miR-129、miR-526b*和miR-520h的作用靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①miR-129在人、鼠、狗、猩猩、雞等動物中保守存在33個可能的靶基因，包括EIF2C3、CAMTA1、SH3KBP1、TGIF2、ING3、DLGAP2等與miRNA加工、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的基因。②miR-526b*僅在人類存

11、在，其可能的作用靶點有771個，包括ABCG2、EIF2C3、CAMK4、CSF2RA等關(guān)于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、造血發(fā)育、凋亡調(diào)控、干細(xì)胞功能維持、miRNAs加工成熟的基因。③miR-520h共有226個可能的作用靶點，在人類、小鼠和類人猿中保守的靶基因共有30個，包括ABCG2、ID1(DNA結(jié)合抑制劑1)、SRP19(一種信號識別蛋白)以及SMAD6(一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)等與干細(xì)胞功能維持、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的調(diào)控蛋白。

12、實驗表明miR-520h具有促進造血干細(xì)胞發(fā)育和分化的功能。 結(jié)論 1、成功研制新型哺乳動物miRNAs檢測芯片，表明利用miRNAs基因芯片來獲取CD34+CD38-造血干細(xì)胞相關(guān)miRNAs是可行的，也為研究其它成體干細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜建立了技術(shù)平臺。 2、篩選到CD34+CD38-造血干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)miRNAs表達(dá)譜，并部分經(jīng)實時定量RT-PCR驗證，為探討miRNAs參與CD34+CD38-造血干細(xì)胞

13、發(fā)育分子機制和生物功能研究奠定了基礎(chǔ)。 3、驗證了miR-129和miR-520h部分作用靶點，表明miRNAs通過調(diào)控EIF2C3、CAMTA1、ABCG2等在miRNA加工、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、干細(xì)胞功能維持等方面的靶基因，從而參與造血干細(xì)胞的發(fā)育，并形成miRNAs基因網(wǎng)絡(luò)，在造血干細(xì)胞發(fā)育進程中起著協(xié)同或者拮抗作用。 4、miR-520h具有顯著的促進造血干細(xì)胞發(fā)育和向祖細(xì)胞分化的作用。研究結(jié)果不僅對miRNA