造血干細胞移植術后sFractalkine與aGVHD關系的初步研究.pdf

1、背景：
　　 異基因造血干細胞移植(allo—HSCT)是治療惡性血液病的有效方法。但急性移植物抗宿主病(aGVHD)是其嚴重的并發(fā)癥之一。目前,aGVHD的診斷主要依靠臨床癥狀:如皮膚出現(xiàn)皮疹、肝功損害、腹瀉等,缺少相對穩(wěn)定和可靠的血清學指標。能否尋找一個血清學指標應用于臨床的早期診斷及早期預測疾病的狀態(tài)是臨床工作者追求的目標。
　　 趨化因子(chemokines,CK)是一類能夠調控細胞定向遷移的細胞因子,廣泛存在

2、于白細胞如單核細胞、巨噬細胞、T細胞和B細胞,并且通過與相應的趨化因子受體結合從而介導對白細胞的趨化作用。一種趨化因子能與多個趨化因子受體相結合,而一個趨化因子可能有多個高親和性受體,它們共同構成復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng),在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡。迄今為止至少已發(fā)現(xiàn)50余種趨化因子,趨化因子結構和功能相似,據(jù)其前兩個半胱氨酸的相對位置不同,大致可分為4個亞族:C、CC、CXC和CX3C趨化因子。目前已明確的趨化因子受體

3、有20多種,它們屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,主要表達于骨髓來源的各白細胞亞群,同時也表達于上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞等類型的細胞上。趨化因子首先作為趨化性介質被發(fā)現(xiàn),但隨著對趨化因子研究的深入,現(xiàn)在已經認識到趨化因子不但對白細胞具有趨化作用,而且在免疫細胞和器官的發(fā)育、免疫應答過程、炎癥反應、病原體感染、創(chuàng)傷修復及腫瘤的形成和轉移等方面發(fā)揮廣泛的生理和病理作用。由于其廣泛的細胞來源和生物學效應,趨化因子在多種炎性和自身免疫性疾病的發(fā)

4、生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　 Fractalkine(Fkn)又稱不規(guī)則趨化因子,是由體內多種組織細胞分泌的具有黏附功能的趨化因子,是1997年發(fā)現(xiàn)的CX3C趨化因子家族中唯一的成員,定位于人染色體16q13,有膜結合型和可溶型兩種形式存在,各自發(fā)揮使外周血白細胞游走和粘附的作用,因此兼有趨化因子和細胞間粘附分子兩種作用。由內皮細胞、成纖維細胞和小膠質細胞表達,當發(fā)生炎癥時表達上調。大多數(shù)Fkn表達在活化的內皮細胞表面,參與

5、白細胞向炎癥組織的游走[1]。由于內皮是白細胞跨膜轉移的第一道屏障,因此內皮細胞表面的Fkn是控制炎癥部位白細胞滲出的門戶[1]。而當Fkn的胞外部分被蛋白酶水解,由細胞表面脫落,變成可溶性不規(guī)則趨化因子(sFkn)。sFkn趨化單核細胞、NK細胞、CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞到血管壁內皮細胞附近,這些炎性細胞被誘導跨膜轉移,同時釋放干擾素-γ(IFN—γ)、腫瘤壞死因子α(TNF—α)、穿孔素和端粒酶等,破壞血管內皮細胞和其

6、他組織細胞,引起血管炎和器官損害。TNF—α能誘導Fkn的脫落,IFN—γ起協(xié)同作用,而白介素(IL)-4或IL-13能完全阻斷Fkn細胞外片段的脫落,提示這些細胞因子也參與Fkn脫落的調控過程[2]。
　　 CX3CR1是Fkn的特異性受體,主要表達在NK細胞、C08 T釧胞、CD14+單核細胞,sFkn分子表現(xiàn)出強有力的趨化這些細胞向上皮細胞、內皮細胞、樹枝狀細胞黏附的活性[3]。Fkn與CX3CR1相互作用也能通過G蛋白轉

7、換信號,提高整合素結合配體的能力。因此,整合素和其配體如ICAM—1(細胞間粘附分子-1)和VCAM-1(血符細胞粘附分子-1)與Fkn/cX3CR1系統(tǒng)共同存在時,可大大提高細胞粘附作用[1,4]。到目前為止,還沒有實驗確切證實Fkn/CX3CR1系統(tǒng)引發(fā)怎樣的細胞內分子水平反應。有研究表明,CX3CR1為G蛋白耦聯(lián)受體,Fkn與CX3CR1結合以后,可以通過與 G蛋白耦聯(lián),啟動細胞內信號轉導機制,促進核因子κB(nuclear fa

8、ctorκB)和TNF—α的表達,從而產生相應的生物學效應[5]。有學者[6]應用磷酸鹽緩沖液(空白對照)和Fkn分別誘導人外周血單核細胞,結果發(fā)現(xiàn),Fkn處理組表達NF—κB的陽性細胞數(shù)以及TNF—α表達值均比對照組顯著增加。在移植免疫中Th1細胞介導排斥反應,而Th2細胞誘導免疫耐受。而TNF—α是Th1型細胞亞群產生的主要細胞因子之一,Fkn可能通過改變Th1/Th2平衡而導致組織損傷,進而發(fā)生aGVHD。
　　 aGVH

9、D是由移植物中所含供者T細胞識別宿主抗原而攻擊宿主組織器官所產生的病理損傷、并導致宿主多臟器損傷的一個疾病過程,是造血干細胞移植常見的嚴重并發(fā)癥。研究表明:IL-1、可溶性IL-2受體(sIL-2R)、TNF—α等在發(fā)生aGVHD時體內水平明顯升高。有研究[7]報道異基因造血干細胞移植術后動態(tài)監(jiān)測TNF-α、IL-4、TGF—α水平變化有助于對aGVHD做出診斷,且對判斷aGVHD輕重程度有一定的臨床意義。但目前總體上還是缺乏一種能夠預

10、警aGVHD發(fā)生的可靠穩(wěn)定的方法。國內外有關Fkn的研究多集中在類風濕病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面[8-11],關于Fkn和aGVHD的相關研究文獻鮮見。Robinson[12]等報道Fkn表達升高可顯著提高對移植心臟的排斥,尤其表現(xiàn)在血管內皮系統(tǒng)損傷,而給予受者抗-CX3CR1阻斷抗體治療后,明顯延長移植物的存活時間；Satoshi Ueha[13]發(fā)現(xiàn)對黏膜血管定居因子和Fkn的干預治療在減輕腸道的移植物抗宿主反應損傷的同時保護了移植物抗

11、腫瘤效應。這些研究提示Fkn表達升高可能預示著aGVHD的發(fā)生。而造血干細胞移植患者經大劑量預處理及干細胞植入并經歷了造血重建和免疫重建過程,當發(fā)生GVHD時,TNF—α、IFN—γ、IL-4都會發(fā)生變化,與細胞趨化作用有關的sFkn在體內有無變化,目前該方面的研究報道不多。
　　 本研究分兩部分,第一部分是建立測定sFkn的方法,為測定allo—HSCT患者移植前后血清sFkn的濃度建立方法,并測定了35例正常人血清sFkn的

12、濃度；第二部分測定20例接受HSCT的惡性血液病患者移植前和移植后不同時間的血清sFkn的濃度。以正常人血清sFkn濃度為對照,探討sFkn與aGVHD兩者之間的關系。
　　 目的：
　　 建立sFkn的測定方法,測定正常人血清sFkn的濃度；觀察造血干細胞移植(HSCT)患者體內sFkn的變化,探討sFkn與急性移植物抗宿主病(aGVHD)的關系。
　　 方法：
　　 第一部分:建立競爭抑制ELISA法

13、測定sFkn,繪制出sFkn的標準曲線；在此基礎上測定正常人血清sFkn的濃度。
　　 1.sFkn測定的具體操作步驟:
　　 1).在操作前準備所有的物品,標準品和樣品的移取均使用微量移液管。取出試驗用品,于室溫(20-25℃)放置15—30分鐘。實驗過程應在室溫(20—25℃)內進行；
　　 2).取出酶標板,按照標準品的次序分別加入100μl的標準品溶液于空白微孔?？瞻孜⒖字屑尤?00μl的樣品,空白對照加

14、入100μl的蒸餾水；
　　 3).在各孔中加入50μl的酶標記溶液；(不含空白對照孔)。將酶標板用封口膠密封后,37℃孵育反應1小時；(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)；
　　 4).洗板.濃縮洗滌液以1:100的比例與蒸餾水稀釋,充分清洗酶標板3-5次,保持各孔有充足的水壓；酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干；
　　 5).各孔加入顯色劑A、B液各50μl；(不含空白對照孔)。20-25℃下避光反應15分鐘；

15、>　　 6).各孔加入50μl終止液,終止反應;
　　 7).30分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值；
　　 8).將OD值與標準品濃度進行曲線擬合,建立方程。由電腦自動計算得出結果。
　　 第二部分:用上述建立的競爭抑制ELISA法定量檢測20例接受HSCT的惡性血液病患者移植前和移植后不同時間的血清sFkn的濃度,以35例正常人血清sFkn的濃度為對照,分析白血病患者移植前后不同時間血清sFk

16、n的濃度變化及與aGVHD的關系。sFkn抗體等由上海藍基生物科技有限公司所提供。全部病人和正常人清晨空腹靜脈采血,采集后立即離心(1000r/min,5min)分離,取上清-20℃保存待測。
　　 2.統(tǒng)計學方法采SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行曲線擬合,繪制標準曲線。采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05則差異具有顯著性意義。
　　 結果：<

17、br>　　 1.成功建立了sFractalkine的測定方法,建立了標準曲線,在0.5～5 ng/ml之間有良好的的劑量效應關系。批內、批間變異系數(shù)分別為14.4％和9.43％。
　　 2.正常人血清sFkn的濃度在為3.9325±0.8027ng/ml。
　　 3.HSCT患者移植前血清sFkn的濃度為4.2806±1.4044ng/ml。其中4例自體HSCT(auto-HSCT)患者移植后15天血清sFkn的濃度為

18、3.6800±1.5451ng/ml；10例異基因HSCT(allo-HSCT)后未發(fā)生急性GVHD患者移植后15d血清sFkn的濃度為3.6240±0.9980ng/ml；6例allo—HSCT后發(fā)生急性GVHD患者移植后15d血清sFkn的濃度為5.7752±0.6618ng/ml。全部患者移植前,auto—HSCT患者、allo—HSCT后未發(fā)生aGVHD的患者,血清sFkn的濃度和正常人比較變化不明顯(P>0.05)；發(fā)生aGV