喉癌相關(guān)miRNAs的篩選及其功能的初步研究.pdf

1、[目的]運(yùn)用miRNA基因芯片技術(shù)、Real-time PCR技術(shù)及miRNA功能實(shí)驗(yàn)，探討 miRNAs與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　[方法]1.應(yīng)用分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳法鑒定抽提 RNA樣本的質(zhì)量；對(duì)抽提的RNA樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記及雜交等處理，在4對(duì)喉癌組織及癌旁組織樣本中篩選喉癌相關(guān)差異表達(dá)的miRNAs。2.在4對(duì)喉癌組織及癌旁組織中，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-99a-5p，miR-195-5p，mi

2、R-3195，miR-101-3p，miR-126-3p的表達(dá)情況驗(yàn)證基因芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性；在28對(duì)喉癌組織及癌旁組織的大樣本中，再次檢測(cè)miR-99a-5p、miR-195-5p、miR-3195、miR-101-3p、miR-126-3p的表達(dá)。檢測(cè)采用ABI7500 PCR儀，數(shù)據(jù)分析用CT分析法，內(nèi)參用SnRNA U6，定量：采用△△CT（Cycle threshold）法相對(duì)定量，計(jì)算公式參照：比率=2-??ct=2-[△

3、Ct(樣品)-△Ct(標(biāo)準(zhǔn)品)]，△Ct= Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參）。3.將合成的miR-3195模擬物(mimic)及抑制物(inhibitor)分別轉(zhuǎn)染至喉癌 Hep2細(xì)胞株中，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組（miR-3195 mimic組、mimic NC組、miR-3195 inhibitor組、inhibitor NC組、未轉(zhuǎn)染組）中觀察miR-3195表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞增殖情況的影響。4.將合成

4、的miR-3195模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染至喉癌 Hep2細(xì)胞株中。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在各個(gè)組（miR-3195 mimic組、mimic NC組、未轉(zhuǎn)染組）中檢測(cè)miR-3195表達(dá)上調(diào)對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。
　　[結(jié)果]1.RNA樣本的質(zhì)量鑒定結(jié)果顯示:抽提的每個(gè)RNA樣本的質(zhì)量均滿足條件，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)相關(guān)軟件分析，從基因芯片檢測(cè)結(jié)果中，篩選出了42個(gè)二倍以上差異表達(dá)的喉癌相關(guān) miRNAs。miR-

5、21-5p、miR-3651、miR-222-3p、miR-1246、miR-181d，miR-193b-3p等22個(gè)miRNAs在4例喉癌組織中的表達(dá)均上調(diào)（Foldchange>2，P<0.05）；miR-99a-5p、miR-195-5p、miR-3195、miR-101-3p、miR-126-3p等20個(gè)miRNAs在4例喉癌組織中的表達(dá)均下調(diào)（Foldchange<0.5，P<0.05）。2.Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果證實(shí)了miR-99a-5p，miR-195-5p，miR-3195，miR-101-3p，miR-126-3p等5個(gè)miRNAs在4例喉癌組織中均下調(diào)，與基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明基因芯片結(jié)果是可靠的。在28例大樣本喉癌組織標(biāo)本中 miR-3195顯著下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-3195 mimic組喉癌Hep2細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，miR-3195表達(dá)上調(diào)

7、顯著抑制細(xì)胞增殖能力；反之，轉(zhuǎn)染miR-3195 inhibitor組喉癌Hep2細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-3195表達(dá)下調(diào)顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。4.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-3195 mimic組喉癌Hep2細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，miR-3195表達(dá)上調(diào)顯著抑制細(xì)胞增殖能力；轉(zhuǎn)染miR-3195 inhibitor組喉癌Hep2細(xì)胞的形成克隆數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0

8、.05)，miR-3195表達(dá)下調(diào)顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。5.流式檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-3195 mimic組喉癌Hep2細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-3195表達(dá)上調(diào)細(xì)胞凋亡率顯著增加。轉(zhuǎn)染miR-3195 mimic組喉癌Hep2細(xì)胞的細(xì)胞周期中，G1期的細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，miR-3195表達(dá)上調(diào)使得喉癌Hep2細(xì)胞阻滯于G1期，向S期轉(zhuǎn)變減少，從而抑制Hep2細(xì)胞的增殖。
　　[結(jié)論]1