水稻類病變基因互作基因的篩選及其功能的初步研究.pdf

1、類病變突變體(lesion mimic mutants，LMMs)是指一類在沒有非生物脅迫或者病原菌侵染時(shí)就能自發(fā)的形成壞死病斑、從而導(dǎo)致植株防御和抗性基因表達(dá)增強(qiáng)的植物突變體。類病變突變體廣泛存在于各類植物中，與細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)及植物抗病有著非常緊密的聯(lián)系且在植物抗逆性、抗病及基因工程等方面有很大的作用和意義。深入了解類病變突變體基因?qū)τ诹私釶CD信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及植物抗病或抗逆的防御系

2、統(tǒng)的研究有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期獲得兩個(gè)水稻類病變突變體Z1828與Z1834。Z1828高抗水稻白葉枯病，且對水稻白葉枯病菌的各生理小種具有廣譜抗性;Z1834對水稻條紋葉枯病具有較強(qiáng)的抗性。實(shí)驗(yàn)室前期已成功定位并克隆了這兩個(gè)突變體的目標(biāo)基因，并通過轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確證了突變體的目標(biāo)基因，而且對目標(biāo)基因的功能做了初步研究。本研究主要是分別篩選并驗(yàn)證這兩個(gè)目標(biāo)基因的互作基因，然后初步研究互作基因的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　

3、1、候選互作基因的篩選。通過酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid，YTH)系統(tǒng)分別篩選并獲得了突變體Z1828和Z1834目標(biāo)基因的候選互作基因。對于突變體Z1828，篩選出4個(gè)候選互作基因，分別為545、546、664-1及664-2，其中互作基因545、664-1及664-2已被成功克隆。候選互作基因545位于第6號染色體上，包含8個(gè)內(nèi)含子，基因編碼序列(coding sequence，CDS)長度為1089 bp，該基因編

4、碼一個(gè)鐵氧還蛋白—NADP還原酶。664-1與664-2為同一基因的不同剪切方式，兩種剪切體之間只有12個(gè)堿基對的差異，該基因位于第2號染色體上，不同的剪切體均包含6個(gè)內(nèi)含子，664-1的CDS長度為639 bp，664-2的CDS長度為651bp，該基因編碼一個(gè)類聚腺苷酸結(jié)合蛋白。546位于第4號染色體，包含3個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)細(xì)胞色素氧化酶組裝蛋白質(zhì)1;由于基因起始位置不明確，目前尚未克隆到546基因的完成序列。對于突變體Z1834

5、的篩庫工作，由于其目標(biāo)基因片段大，且編碼一個(gè)抗性蛋白，最初以其完整的CDS序列進(jìn)行篩庫，酵母不能正常生長，這可能是由于外源抗性蛋白對酵母的生長具有抑制作用。因此將該基因的CDS序列分成兩段分別進(jìn)行篩庫，最終獲得一個(gè)候選互作基因1-5，該基因位于第6號染色體，包含7個(gè)內(nèi)含子，其CDS長度為1137 bp，編碼一個(gè)類線粒體前體甲酸脫氫酶蛋白。
　　2、候選互作基因的驗(yàn)證。對于突變體Z1828目標(biāo)基因的候選互作基因，分別利用雙分子熒光互

6、補(bǔ)(Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC)和YTH系統(tǒng)對已克隆的3個(gè)候選互作基因進(jìn)行了互作結(jié)果的驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆證實(shí)目標(biāo)基因與候選基因互作。通過構(gòu)建目標(biāo)基因與互作基因YFP融合表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至煙草細(xì)胞表達(dá)互作來對其進(jìn)行BiFC互作驗(yàn)證，結(jié)果表明，545與目標(biāo)基因在細(xì)胞外周表達(dá)互作，664-1及664-2與目標(biāo)基因在細(xì)胞外周及細(xì)胞核均表達(dá)互作;通過構(gòu)建目標(biāo)基因與互作基因

7、獵物載體與誘餌載體，進(jìn)行YTH驗(yàn)證，在SD-4固體培養(yǎng)基上，其菌落顯藍(lán)且生長狀況良好，表現(xiàn)為互作。對于突變體Z1834目標(biāo)基因的互作基因1-5，經(jīng)BiFC與YTH驗(yàn)證均無結(jié)果。BiFC驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中無熒光;YTH驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，在SD-4固體培養(yǎng)基上，菌落只顯藍(lán)而生長被抑制，表現(xiàn)為不互作，這可能由多方面原因?qū)е拢€需調(diào)整實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3、候選互作基因的轉(zhuǎn)基因及突變植株的表型。將3個(gè)候選互作基因在突變體Z1828植株中超表達(dá)，

8、545的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)類病斑的時(shí)間較突變體延遲，且葉片上的病斑數(shù)量及密度明顯少于突變體植株，表現(xiàn)為表型部分恢復(fù);而664-1及664-2的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株有少數(shù)出現(xiàn)類病斑時(shí)間延遲，但最終病斑爆發(fā)與突變體Z1828植株無明顯差異，這可能預(yù)示著該候選基因的功能處于目標(biāo)基因調(diào)控的上游;未被成功克隆的候選互作基因546的T-DNA插入突變體出現(xiàn)與突變體Z1828植株相似的表型，從植株表型上進(jìn)一步證明了546為目標(biāo)基因的互作基因。
　

9、　4、候選互作基因的亞細(xì)胞定位。構(gòu)建了sGFP融合表達(dá)載體，對候選互作基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。對于突變體Z1828目標(biāo)基因的互作基因，545的定位結(jié)果較為復(fù)雜，出現(xiàn)3種情況，1、只在葉綠體中表達(dá)，2、在沒有葉綠體的細(xì)胞中會(huì)在細(xì)胞核與細(xì)胞外周表達(dá)，3、在整個(gè)細(xì)胞的各個(gè)部位都有表達(dá)。664-1與664-2的煙草葉片細(xì)胞與水稻原生質(zhì)體細(xì)胞的定位略有差異，在水稻原生質(zhì)體中它們在細(xì)胞核及細(xì)胞外周均有表達(dá)，而在煙草細(xì)胞中只在細(xì)胞核中表達(dá)，這種現(xiàn)象