水稻OsVDAC3的功能分析及互作蛋白的篩選.pdf

1、電壓依賴(lài)性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）蛋白是線粒體外膜孔狀蛋白，具有多種重要的生理生化功能。本實(shí)驗(yàn)室在水稻日本晴基因組中鑒定了8個(gè)osvdac基因，但多數(shù)的功能仍不清楚。
　　本文為了研究osvdac3功能，構(gòu)建了水稻osvdac3植物RNA干涉載體，遺傳轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；對(duì)已經(jīng)得到的pCAMBIA1302-osvdac3超表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化的T1代植株進(jìn)行非生物脅迫實(shí)

2、驗(yàn)；另外，構(gòu)建膜蛋白酵母雙雜誘餌蛋白載體篩選水稻膜系統(tǒng)cDNA文庫(kù)中與OsVDAC3相互作用的蛋白。綜合分析，得到的主要結(jié)果如下：
　　1、根據(jù)osvdac3基因的ORF設(shè)計(jì)特異性干涉引物，將其克隆到植物干涉雙元載體pMCG161中，構(gòu)建了pMCG161-osvdac3干涉載體，以水稻日本晴為受體由農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，通過(guò)檢測(cè)引物PMCG3F/3R和PMCG2F/2R對(duì)轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA特異性擴(kuò)增鑒定，得到了6株

3、RNA干涉陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR結(jié)果表明，4株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中osvdac3基因表達(dá)量是轉(zhuǎn)基因陰性植株20-50％。
　　2、以轉(zhuǎn)入植物超表達(dá)載體的T1代轉(zhuǎn)基因植株幼苗為材料，RT-PCR檢測(cè)超表達(dá)植株osvdac3基因的表達(dá)量，并對(duì)超表達(dá)陽(yáng)性幼苗進(jìn)行鹽和甘露醇脅迫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示超表達(dá)的osvdac3在鹽脅迫中促進(jìn)了根的伸長(zhǎng)，在甘露醇脅迫中促進(jìn)了苗和根的伸長(zhǎng)，推測(cè)osvdac3能提高水稻對(duì)鹽和干旱的雙重抗性。
　　3、

4、構(gòu)建膜蛋白酵母雙雜交誘餌蛋白載體pBT3-N-osvdac3ORF&pBT3-SUC-osvdac3 ORF，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，判斷出osvdac3的N端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，C端位于細(xì)胞質(zhì)外，因此確定pBT3-N-osvdac3ORF作為誘餌蛋白載體，并摸索得出3-AT濃度為7.5 mmol/L時(shí)嚴(yán)謹(jǐn)性最佳。以pBT3-N-osvdac3ORF篩選水稻YTB幼穗膜系統(tǒng)cDNA文庫(kù)，以及菌落轉(zhuǎn)移過(guò)濾染色實(shí)驗(yàn)，鑒定出了3個(gè)與OsVDAC3相互作