水稻白葉枯病菌無(wú)毒基因avrXa23的克隆及與AvrXa23互作的水稻蛋白的功能分析.pdf

1、由黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一，嚴(yán)重制約水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。水稻與Xoo的互作是研究植物與病原物互作的模式系統(tǒng)之一。寄主植物水稻（粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11等）和病原菌Xoo（韓國(guó)菌株KACC10331、日本菌株MAFF311018和菲律賓菌株P(guān)XO99A等）的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，為深入研究水稻與Xoo的互作奠定了生物信息基礎(chǔ)

2、。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期利用EZ-Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，構(gòu)建了白葉枯病原菌PXO99A的突變體庫(kù)，通過(guò)篩選PXO99A的突變體庫(kù)，獲得14個(gè)使CBB23感病的突變菌株。在此基礎(chǔ)上，對(duì)這14個(gè)突變菌株的Tn5插入位點(diǎn)進(jìn)行側(cè)翼序列分析，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)菌株Tn5插入在TALE（Transcription activator-like effectors）類(lèi)基因的位置，這3個(gè)菌株分別命名為P99M2、P99M4和P99M5。
　　本論文分為兩部分

3、：第一部分是克隆與水稻白葉枯病廣譜抗病基因Xa23對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因avrXa23；第二部分是篩選水稻中與AvrXa23互作的蛋白，并對(duì)相關(guān)蛋白及其編碼基因進(jìn)行功能分析。獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)篩選PXO99A的Cosmid基因組文庫(kù)，獲得34個(gè)含有TALE類(lèi)基因的Cosmid質(zhì)粒（簡(jiǎn)稱(chēng)C1-C34）。將這34個(gè)Cosmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到突變體菌P99M5中，發(fā)現(xiàn)C15轉(zhuǎn)化進(jìn)入P99M5后能夠激發(fā)CBB23的抗病性，說(shuō)明C15含

4、有與Xa23基因?qū)?yīng)的無(wú)毒基因。
　　2.經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)C15中含有talC9a和talC9b兩個(gè)候選的無(wú)毒基因。構(gòu)建talC9a和talC9b的表達(dá)載體，分別命名為pHM1-Mi和pHM1-L。pHM1-L轉(zhuǎn)化進(jìn)入P99M5等突變體菌中能夠使 CBB23抗病，而pHM1-Mi無(wú)此功能。說(shuō)明talC9b是與Xa23相對(duì)應(yīng)的Xoo無(wú)毒基因avrXa23。
　　3. avrXa23是TALE類(lèi)基因，全長(zhǎng)4452bp，編碼蛋白

5、含1483氨基酸。通過(guò)Southern blot方法，證實(shí)avrXa23存在于國(guó)內(nèi)外Xoo代表性菌株中。AvrXa23可以激活水稻中抗病基因Xa23的表達(dá)，avrXa23的廣泛存在可以解釋Xa23對(duì)于白葉枯病菌的廣譜抗病性。
　　4.構(gòu)建PXO99A誘導(dǎo)CBB23的cDNA文庫(kù)。以AvrXa23為誘餌，篩選該cDNA文庫(kù)，初篩獲得323個(gè)侯選克隆。通過(guò)測(cè)序后排除移碼、復(fù)篩進(jìn)一步驗(yàn)證獲得43個(gè)候選陽(yáng)性克隆。這43個(gè)克隆編碼26種蛋白

6、質(zhì)，其中7個(gè)可能與抗病相關(guān)。將這7個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增并構(gòu)建成prey載體進(jìn)行酵母雙雜交驗(yàn)證，然后進(jìn)行GST pull-down體外驗(yàn)證，最終證明3個(gè)水稻蛋白質(zhì)（OsIMPα、OsTHIC和OsTHI1）與AvrXa23互作。
　　5.生物信息學(xué)分析表明，OsIMPα為核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能輔助AvrXa23進(jìn)入細(xì)胞核；OsTHIC為嘧啶環(huán)前體合成酶，OsTHI1為噻唑合成酶，兩者都是維生素B1合成的關(guān)鍵酶。維生素B1作為植物抗病反

7、應(yīng)的激活劑，通過(guò)水楊酸和Ca2+相關(guān)的信號(hào)途徑，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，對(duì)水稻抵抗Xoo的侵染具有重要作用。
　　6.進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，OsTHI1與 AvrXa23的 N端互作；OsTHI1定位在葉綠體上；利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻近等基因系CBB4（含Xa4，抗白葉枯病原菌PXO61）中的OsTHI1，獲得的轉(zhuǎn)基因植株葉片維生素B1含量下降，且對(duì)PXO61感病。
　　總之，本研究成功克隆到對(duì)應(yīng)于Xa23