水稻紋枯病菌誘導(dǎo)差異表達(dá)基因的功能分析.pdf

1、由立枯絲核菌引起的紋枯病是我國水稻最重要的病害之一，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可致水稻大量減產(chǎn)。水稻對紋枯病的抗性受多基因控制，由于抗病表型鑒定困難，加上抗病數(shù)量或相關(guān)基因的效應(yīng)普遍較小，導(dǎo)致有關(guān)水稻抗紋枯病基因的研究報(bào)道一直較少，嚴(yán)重影響水稻抗紋枯病分子機(jī)理的研究。本實(shí)驗(yàn)室前期通過全基因組芯片表達(dá)譜技術(shù)，以紋枯病抗病品種YSBR1和感病品種Lemont為材料，分別在接種紋枯病菌后10小時(shí)和20小時(shí)上篩選到一批紋枯病菌誘導(dǎo)差異表達(dá)基因。本研究結(jié)合紋枯病

2、抗性QTL定位位置以及在YSBR1中特異誘導(dǎo)表達(dá)和抗病相關(guān)基因等信息，從這些差異表達(dá)基因中篩選出9個(gè)基因進(jìn)行研究，獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、通過已知生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，得知各基因分別編碼白粉病抗病蛋白PM3F（本研究將其命名為OsPM3F）、MLO同源蛋白(OsMLO)、質(zhì)膜蛋白(OsPIP)、纖維素合酶A6類似蛋白(OsCs1A)、β擴(kuò)張素蛋白前體(OsEXPR)、FK506結(jié)合蛋白(OsFKBP65)、RNA結(jié)合相關(guān)蛋白(O

3、sRNP)、Gigantea蛋白(OsGI)、鳥苷酸激酶(OsV2)。
　　2、通過qRT-PCR，對其中7個(gè)基因（不包括OsGI和OsV2）的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)除了OsRNP主要在苗期高表達(dá)之外，其余6個(gè)基因均在分蘗末期或之后的發(fā)育階段中具有較強(qiáng)表達(dá);在表達(dá)部位上，發(fā)現(xiàn)除了OsCslA在穗中明顯強(qiáng)表達(dá)之外，其余6個(gè)基因在葉片和/或葉鞘中均有較強(qiáng)表達(dá)。進(jìn)一步分析了各基因?qū)y枯病菌和白葉枯病菌的侵染響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)各基因在侵染

4、后的不同時(shí)間點(diǎn)、不同品種以及針對不同病原菌間的誘導(dǎo)表達(dá)特征上均存在明顯差異，表明這些基因確實(shí)是抗病相關(guān)基因，但所涉及的抗病調(diào)控途徑可能不同。
　　3、構(gòu)建了9個(gè)基因的RNAi載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法，在YSBR1背景下獲得了各基因的RNAi轉(zhuǎn)基因植株，通過連續(xù)世代的PCR鑒定，獲得了部分轉(zhuǎn)基因純合系。對轉(zhuǎn)基因純合系中各靶基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)RNAi株系中的靶基因表達(dá)受到了明顯下調(diào)，最高降幅超過90％。

5、r>　　4、對率先獲得的8個(gè)基因（除OsEXPR）的部分純合轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行離體紋枯病菌接種鑒定，證實(shí)降低OsV2的表達(dá)可顯著削弱YSBR1的抗病性，表明OsV2與水稻對紋枯病菌的抗性有關(guān);OsPM3F、OsMLO和OsRNP的相關(guān)RNAi株系對紋枯病的抗性也顯著低于對照YSBR1，初步認(rèn)為這些基因也參與水稻對紋枯病的抗性調(diào)控，但仍需要更多轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行佐證;其余基因的RNAi株系的表型結(jié)果不夠一致，需一步研究。
　　5、在大田條件下，

6、對6個(gè)基因(不包括OsEXPR、OsV2和OsGI)的RNAi純合系進(jìn)行了白葉枯病菌接種鑒定，發(fā)現(xiàn)OsPIP-RNAi、OsRNP-RNAi、OsFKBP65-RNAi和OsCslA-RNAi的相關(guān)RNAi系的病班長度均顯著長于對照YSBR1，說明下調(diào)這些基因的表達(dá)顯著降低YSBR1對白葉枯病的抗性;OsMLO-RNAi的2個(gè)轉(zhuǎn)基因系的病斑長度與對照YSBR1間均不存在顯著差異，表明該基因不參與水稻對白葉枯病的抗性調(diào)控;OsPM3F-R