NaCl脅迫下小黑楊差異表達(dá)基因及其功能分析.pdf

1、為研究小黑楊在不同鹽濃度和不同脅迫時(shí)間的生理響應(yīng),本實(shí)驗(yàn)測(cè)定0、75、150、250 mM NaCl脅迫下,小黑楊第6小時(shí)和第1、2、4、6、8天的SOD活性、POD活性、MDA含量及葉綠素相對(duì)含量,結(jié)果表明:隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和鹽濃度的增加,小黑楊葉綠素相對(duì)含量逐漸降低,MDA含量升高。POD和SOD的活性則呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)小黑楊葉部形態(tài)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),250 mM NaCl脅迫第二天,葉片失水,葉柄變軟;隨著脅迫的持續(xù)進(jìn)行

2、,葉片萎蔫變黃直至最后變成褐色,卷曲變脆。以上結(jié)果表明小黑楊并非強(qiáng)耐鹽植物,對(duì)低濃度鹽有一定耐受性,但高濃度鹽則會(huì)對(duì)其造成傷害。
　　 為進(jìn)一步研究鹽脅迫下小黑楊基因應(yīng)答機(jī)理,以正常生長(zhǎng)和鹽脅迫下的小黑楊葉片為試材,進(jìn)行cDNA-AFLP分析。64對(duì)引物組合共獲得4407條轉(zhuǎn)錄基因片段,其中差異片段2027條(其中上調(diào)表達(dá)996條,下調(diào)表達(dá)1031條)。回收161條差異條帶,成功再擴(kuò)增與克隆121條差異片段,測(cè)序得到107條原始

3、序列,經(jīng)聚類(lèi)分析后得到86條唯一序列,Genbank登錄號(hào)為GW672587-GW672672,其功能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等10個(gè)功能類(lèi)別。其中功能未知的基因占最高比例,約為18.6％;其次為參與代謝的基因,約占17.44％;參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因約為12.79％,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因占11.63％;,與細(xì)胞合成相關(guān)的基因占10.47％,轉(zhuǎn)運(yùn)占4.65％,細(xì)胞降解占4.65％,參與應(yīng)激反應(yīng)的基因占5.81％、發(fā)育相關(guān)基

4、因占6.98％、光合作用與氧化還原的基因均占6.98％。
　　 環(huán)鋅指蛋白基因是小黑楊鹽脅迫后誘導(dǎo)表達(dá)的基因,應(yīng)用RACE技術(shù)克隆出具有完整開(kāi)放讀碼框的小黑楊環(huán)鋅指蛋白(PsnRZF)基因,該基因全長(zhǎng)1061 bp,其中5’非翻譯區(qū)為184 bp,3’非翻譯區(qū)為82 bp,開(kāi)放讀碼框?yàn)?95 bp,編碼264個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白的分子量為30.25 kDa,理論等電點(diǎn)為8.04。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示;小黑楊PsnRZF基因

5、在不同器官中表達(dá)量存在差異,該基因在葉中的表達(dá)量最高,其次為莖,在根中的表達(dá)量最低。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),PsnRZF基因在葉和莖中的表達(dá)量變化均呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢(shì),在葉中該基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)在脅迫后的第6天,在莖中該基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)在脅迫后的第4天;而在根中,該基因表達(dá)量的變化不顯著。
　　 為驗(yàn)證小黑楊環(huán)鋅指蛋白(PsnRZF)基因的功能,構(gòu)建植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因?qū)霟煵葜?。通過(guò)對(duì)正常生