鹽脅迫下甜瓜cDNA文庫(kù)構(gòu)建及NAC基因的功能分析.pdf

1、甜瓜（Cucumis melo L.）是世界上重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物，廣泛栽培在干旱或半干旱地區(qū)。我國(guó)甜瓜栽培面積與產(chǎn)量位居世界前列。全世界可耕地面積的20％受到土壤次生鹽漬化的影響，土壤的鹽漬化使得作物生長(zhǎng)發(fā)育滯緩，甚至植株死亡，產(chǎn)量品質(zhì)下降。
　　對(duì)于土壤鹽漬化給作物帶來(lái)的威脅，培育優(yōu)良的耐鹽品種是一個(gè)較好的策略，植物抗逆（耐鹽）成為當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)。植物對(duì)于鹽脅迫的響應(yīng)、抵抗是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。植物耐鹽代謝有關(guān)通路依然不甚清

2、晰。本文以課題組前期篩選的兩個(gè)甜瓜品種（‘冰雪脆’為耐鹽;‘玉露’為鹽敏感材料），通過(guò)分子生物學(xué)和生理生化等相關(guān)方面的技術(shù)開(kāi)展甜瓜鹽響應(yīng)基因的篩選、家族分析、功能驗(yàn)證等工作。主要研究結(jié)果如下。
　　以甜瓜幼苗冰雪脆、玉露的根為材料，通過(guò)抑制差減雜交的方法構(gòu)建了兩個(gè)cDNA文庫(kù)。‘冰雪脆’文庫(kù)339個(gè)、‘玉露’文庫(kù)604個(gè)EST測(cè)序，對(duì)其中的27個(gè)ESTs進(jìn)行QRT-PCR鑒定與表達(dá)分析，24個(gè)ESTs受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。ESTs經(jīng)過(guò)

3、MIPS數(shù)據(jù)庫(kù)功能分類，耐鹽品種冰雪脆在代謝、細(xì)胞命運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞修復(fù)比鹽敏感品種玉露所占的比例分別要大4％、1.46％、0.94％、0.4％。
　　對(duì)其中一類轉(zhuǎn)錄因子NAC進(jìn)行深入分析。利用甜瓜基因組數(shù)據(jù)對(duì)甜瓜CmNAC基因家族進(jìn)行鑒定、染色體分布、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。我們一共鑒定到甜瓜中有82個(gè)NAC，大多數(shù)甜瓜NAC蛋白具有高度保守的N端，并被分為5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(A-E)，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控domain的高度變異的C端，而5 CmN

4、ACs(CmNAC20、CmNAC22、CmNAC75、CmNAC28和CmNAC62)缺乏保守的A結(jié)構(gòu)域，其中CmNAC75、CmNA C28缺乏B、C和D結(jié)構(gòu)域。對(duì)甜瓜NAC蛋白的保守motif進(jìn)行分析，相同亞家族的成員有著相似的motif組成，大多數(shù)保守motif分布在保守的N端，而在可變域的C端幾乎沒(méi)有保守motif的存在。鑒定出6個(gè)CmNAC(7.3％)轉(zhuǎn)錄因子具有跨膜結(jié)構(gòu)域。NAC基因在第11號(hào)染色體上分布最多（11個(gè)），第

5、五條染色體上僅有4個(gè)NAC基因，還有3個(gè)NAC基因無(wú)法定位到具體的染色體上。通過(guò)軟件分析，82個(gè)甜瓜NAC蛋白經(jīng)過(guò)多重序列比對(duì)、進(jìn)化分析后分為7個(gè)亞家族，第Ⅰ和Ⅳ亞家族的基因數(shù)目最多(19個(gè))，第Ⅶ亞家族數(shù)目最少（5個(gè)）。結(jié)合擬南芥NAC基因組數(shù)據(jù)，甜瓜NAC和擬南芥NAC基因家族共分8個(gè)亞家族，其中第Ⅳ亞家族和第Ⅵ亞家族分布最多（各有19個(gè)CmNAC），第Ⅶ亞家族僅有3個(gè)CmNAC基因。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、前期文庫(kù)數(shù)據(jù)、擬南芥中與

6、鹽脅迫相關(guān)的NAC數(shù)據(jù)對(duì)甜瓜CmNAC的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、文庫(kù)數(shù)據(jù)、擬南芥與鹽相關(guān)的NAC主要集中在第Ⅳ亞家族，特別是第Ⅳ亞家族中的第二分支。對(duì)第二分支的9個(gè)CmNAC進(jìn)行鹽脅迫下表達(dá)分析，顯示8個(gè)NAC受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，一個(gè)CmNAC基因的表達(dá)受到鹽脅迫的抑制。對(duì)其中的CmNAC34和CmNAC14基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)酵母功能驗(yàn)證，它們?cè)黾恿私湍讣?xì)胞對(duì)鹽分敏感程度，且CmNAC34可以抑制酵母的正常生長(zhǎng)。
　　對(duì)表達(dá)量隨

7、著鹽脅迫時(shí)間增加而表達(dá)量增加的一個(gè)CmNAC14進(jìn)行克隆全長(zhǎng)、組織表達(dá)分析和逆境表達(dá)分析（干旱，熱，冷以及ABA）。表明該基因受到干旱、熱、冷以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，在花中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量較少。通過(guò)煙草表皮亞細(xì)胞定位，得知該基因定位于細(xì)胞核上。對(duì)上述CmNAC14轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)對(duì)相關(guān)逆境基因表達(dá)和生理指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果顯示，與野生型擬南芥相比，過(guò)量表達(dá)CmNAC14轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下對(duì)鹽分敏感且根系生長(zhǎng)受到抑制，逆境基因COR47